广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA基因多态性的初步分析

裴永峰，李恒聪，何宁宇，黄惠妮

(南宁中心血站，南宁输血医学研究所，广西 南宁 530007)

·论著·

广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA基因多态性的初步分析

裴永峰，李恒聪，何宁宇，黄惠妮

(南宁中心血站，南宁输血医学研究所，广西 南宁 530007)

目的建立广西地区壮族和汉族血小板供者人类白细胞抗原(HLA)基因分型资料库，分析其HLA- A、B基因频率及单体型频率的分布，解决临床患者的血小板输注无效(PTR)。方法采用聚合酶链反应- 序列特异寡核苷酸探针杂交技术(PCR- SSOP)对广西地区172名壮族和403名汉族的单采血小板捐献者进行HLA- A、B基因分型。结果广西地区壮族血小板捐献者HLA- A和HLA- B位点的基因频率都符合Hardy- Weinberg遗传平衡(P>0.05)，共检出 11种HLA- A等位基因、24种HLA- B等位基因和 58种单倍体型；广西地区汉族血小板捐献者HLA- A和HLA- B位点的基因频率都不符合Hardy- Weinberg遗传平衡(P<0.05)，共检出 14种HLA- A等位基因、30种HLA- B等位基因和 100种单倍体型。结论广西地区壮族和汉族血小板供者 HLA基因特点比较接近中国南方人群，但也有广西地区特点，该结果可以为 PTR患者迅速寻找到HLA相合血小板提供帮助。

血小板捐献者； 人类白细胞抗原； 基因频率； 单倍体型； 广西壮族； 广西汉族

血小板携带的抗原可分为两大类，即血小板相关性抗原和血小板特异性抗原(HPA)，其中人类白细胞抗原(HLA)- A、HLA- B及HPA在血小板输注中具有临床意义。血小板输注无效(PTR)被定义为至少2次ABO血型相合而保存时间少于72h的血小板输注后，输注效果不满意。在多次输注血小板治疗的患者中发生率为30%～70%[1]。临床引发PTR的原因主要是由反复输血后患者产生HLA抗体和HPA抗体所致[2]。

据报道，PTR患者中HLA抗体阳性率约占80%，而单纯HPA抗体阳性仅占少数[1]。鉴于HLA的遗传多态性具有人种、民族及地域上的差异，结合群体遗传资料建立适当规模的已知HLA分型信息的无偿血小板供者库，可迅速找到匹配供者，已成为解决PTR的有效方法[3- 4]。本研究应用聚合酶链反应- 序列特异寡核苷酸探针杂交技术(PCR- SSOP)，对广西地区壮族和汉族固定单采血小板捐献者进行HLA- A、HLA- B基因分型并形成数据库，分析其HLA- A、HLA- B基因频率及单体型频率，以期为解决广西地区的PTR者提供帮助。

1 对象与方法

1.1 研究对象

广西地区固定无偿血小板捐献者575名，且无血缘关系。每人采集血样5 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。其中，172名为壮族，年龄20～50岁，男109名，女63名；403名为汉族，年龄23～50岁，男235名，女168名。

1.2 仪器与试剂

Luminex- 100液态芯片检测系统(美国 Luminex)，9700型PCR扩增仪(美国ABI)，Thermo SCIENTIFIC NANODROP 1000核酸蛋白测定仪(美国 Gene)，全自动凝胶成像分析系统(英国 Bio- best)，全功能水平电泳系统(美国 Embi Tec)，HLA- A、B(SSO)分型试剂(美国 Lifecodes，LOT- A：04145D，LOT- B：10135C)，DNA提取试剂(QIAamp DNA blood mini kit，51104，荷兰)，单通道和八通道移液器(德国Eppendorf)。

1.3 实验方法

严格按试剂说明书提取DNA，用核酸蛋白测定仪确定DNA质量，DNA浓度为40～100 ng·μl-1，OD A260 nm/280 nm为1.7～1.9，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测无DNA降解现象。HLA- A、B基因分型操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理

采用直接计算法计算每个等位基因的频率，数据用SPSS 19.0统计软件分析，两组间的等位基因频率比较采用四格表χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义，OR为比值比，CI为可信区间。每个位点的Hardy- Weinberg平衡检验和单倍体型频率应用Arlequin(3.5.2.2)软件进行[5]。

1.5 血小板供者库最小规模评价[6]

假设有95%的把握在供者库中检测到该单倍体型，采用单倍体型频率(HP)估算供者库规模，N=-1.3010/Lg(1-2HP+HP2)，其中N为血小板供者库所需的最少人数，HP为单倍体型频率。

2 结 果

2.1 广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA- A位点的基因频率比较

具体见表1，其中壮族共检出等位基因11个，基因频率在前5位的等位基因分别是A*11、A*02、A*24、A*68和A*26，共占该位点基因频率的97.39%。汉族共检出等位基因14个，基因频率在前5位的等位基因分别是A*11、A*02、A*24、A*33和A*26，共占该位点基因频率的91.57%。分析可见，A*02的基因频率壮族高于汉族(P<0.05)，A*68的基因频率壮族显著高于汉族(P<0.01)，A*33基因频率壮族显著低于汉族(P<0.01)，其余等位基因的频率相比差异没有统计学意义。

2.2 广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA- B位点的基因频率比较

具体见表2，壮族共检出等位基因24个，基因频率在前5位的等位基因分别是B*46、B*15∶XX/B75、B*13、B*40∶XX/B60和B*58，共占该位点基因频率的61.34%。汉族共检出等位基因30个，其基因频率在前5位的等位基因分别B*46、B*40∶XX/B60、B*13、B*15∶XX/B75和B*58，共占该位点基因频率的56.83%。两个民族该位点所有等位基因的频率相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA-A位点基因频率比较

等位基因/特异性广西壮族(n=172)广西汉族(n=403)等位基因数基因频率等位基因数基因频率χ2值P值OR95%CIA*11∶XX/A111270.36922660.33001.6440.200A*02∶XX/A21230.35762330.28915.2890.0211.3691.047～1.789A*24∶XX/A24440.12791320.16382.3930.122A*68∶XX/A68330.095940.005064.0720.00021.2757.475～60.548A*26∶XX/A2680.0233210.02610.0770.788A*03∶XX/A330.0087200.02483.1860.074A*30∶XX/A3020.0058140.01742.3470.126A*23∶XX/A2310.002920.00251.000A*29∶XX/A2910.002990.01120.297A*31∶XX/A3110.002970.00870.448A*33∶XX/A3310.0029860.106737.1430.0000.0240.003～0.176A*01∶XX/A100.000070.0087A*69∶XX/A6900.000010.0012A*74∶XX/A7400.000040.0050

2.3 广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA- A和HLA- B位点的Hardy- Weinberg平衡检验

壮族的结果见表3，两个位点都符合Hardy- Weinberg遗传平衡 (P>0.05)。汉族的结果见表4，两个位点都不符合Hardy- Weinberg遗传平衡 (P<0.05)。

2.4 广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA基因频率(>0.1)与其他种族、群体的比较

壮族与其他种族、群体的比较结果见表5。A*11∶XX、B*15∶XX、B*40∶XX的基因频率与中国南方汉族[7]存在的差异具有统计学意义；7个等位基因的基因频率与日本[8]、德国[9]存在的差异均具有统计学意义；除了B*40、B*46外，其余5个等位基因的基因频率与泰国[10]存在的差异均具有统计学意义；除了B*46在美国黑人[11]中没有检测到，其余6个等位基因的基因频率与广西壮族存在的差异均具有统计学意义。

汉族与其他种族、群体的比较结果见表6。B*40∶XX的基因频率与中国南方汉族[7]存在的差异具有统计学意义；7个等位基因的基因频率与日本[8]存在的差异均具有统计学意义；除了A*02、A*24和B*46外，其余4个等位基因的基因频率与泰国[10]存在的差异均具有统计学意义；除了B*46在美国黑人[11]中没有检测到，其余6个等位基因的基因频率与广西汉族存在的差异均具有统计学意义；除了A*02∶XX，其余6个等位基因的基因频率与德国[9]存在的差异均具有统计学意义。

2.5 广西地区壮族和汉族血小板捐献者2个位点单倍型及频率(>0.01)分析

壮族中观察到58个HLA- A- B单倍型，汉族中观察到100个HLA- A- B单倍型，两个民族频率大于1%的HLA- A- B单倍型见表7，排在前3位的单倍型是一样的，分别是A*02∶XX- B*46∶XX、A*11∶XX- B*15∶XX 和A*33∶XX- B*58∶XX。

2.6 广西地区壮族和汉族血小板捐献者供者库最少规模评价

按照单倍体型频率(HP)=0.01来计算，血小板供者库规模约为150人。壮族HP>0.01的所有HP之和为0.820 1，即一个150人的供者库超过82%的患者有95%的可能性找到至少1例HLA相合的供者；汉族单倍体型>0.01的所有HP之和为0.724 3，即一个150人的供者库超过72%的患者有95%的可能性找到至少1例HLA相合的供者。

表2广西地区壮族和汉族人群血小板捐献者HLA-B位点基因频率比较

等位基因/特异性广西壮族(n=172)广西汉族(n=403)等位基因数基因频率等位基因数基因频率χ2值P值B*46∶XX/B46550.15991200.14890.2260.634B*15∶XX/B75430.1250800.09931.6730.196B*13∶XX/B13420.1221910.11290.1990.655B*40∶XX/B60410.11921070.13280.3960.529B*58∶XX/B58300.0872600.07440.5450.460B*38∶XX/B38270.0785500.06201.0450.307B*55∶XX/B55200.0581340.04221.3720.242B*15∶XX/B62190.0552390.04840.2360.627B*51∶XX/B51110.0320410.05091.9930.158B*56∶XX/B56110.0320140.01742.4190.120B*48∶XX/B4860.0174230.02851.2070.272B*54∶XX/B5460.0174160.01990.0750.785B*27∶XX/B2750.0145120.01490.0020.964B*35∶XX/B3550.0145190.02360.9640.326B*52∶XX/B5240.0116100.01241.000B*40∶XX/B6140.0116160.01990.9540.329B*07∶XX/B730.0087150.01861.5300.216B*39∶XX/B3930.0087150.01861.5300.216B*57∶XX/B5720.005860.00741.000B*67∶XX/B6720.005840.00501.000B*15∶XX/B7620.005830.00370.639B*18∶XX/B1810.002930.00371.000B*44∶XX/B4410.0029120.01490.124B*50∶XX/B5010.002910.00120.509B*08∶XX/B800.000040.0050B*37∶XX/B3700.000010.0012B*41∶XX/B4100.000010.0012B*15∶XX/B7000.000020.0025B*15∶XX/B7100.000060.0074B*15∶XX/B7700.000010.0012

表3广西地区壮族血小板捐献者HLA-A、 -B的Hardy-Weinberg平衡检验结果

位点样本数观察值期望值P值HLA-A1720.691860.710080.46341HLA-B1720.901160.889790.79040

表4广西地区汉族血小板捐献者HLA-A、-B的Hardy-Weinberg平衡检验结果

位点样本数观察值期望值P值HLA-A4030.764270.768330.00437HLA-B4030.895780.898990.02624

表5广西地区壮族血小板捐献者HLA基因频率(>0.1)与其他种族、群体的比较

等位基因/特异性广西壮族(n=172)中国南方汉族(n=4707)日本(n=18604)泰国(n=16807)美国黑人(n=564)德国(n=8904)A*02∶XX/A20.35760.30710.2471b0.2924b0.1773b0.3003aA*11∶XX/A110.36920.3173a0.0934b0.2770b0.0133b0.0508bA*24∶XX/A240.12790.15600.3724b0.1734a0.0221b0.0891aB*13∶XX/B130.12210.09160.0146b0.0790b0.0106b0.0124bB*15∶XX/B750.12500.0673b0.0091b0.0770b0.0115b0.0312aB*40∶XX/B600.11920.0024b0.0536b0.10400.0106b0.0004bB*46∶XX/B460.15990.14720.0477b0.1320NT0.0478b

与广西壮族比较，aP<0.05,bP<0.01

注：NT为未检测

表6广西地区汉族血小板捐献者HLA基因频率(>0.1)与其他种族、群体的比较

等位基因/特异性广西汉族(n=403)中国南方汉族(n=4707)日本(n=18604)泰国(n=16807)美国黑人(n=564)德国(n=8904)A*02∶XX/A20.28910.30710.2471b0.29240.1773b0.3003A*11∶XX/A110.33000.31730.0934b0.2770b0.0133b0.0508bA*24∶XX/A240.16380.15600.3724b0.17340.0221b0.0891bA*33∶XX/A330.10670.09130.0751a0.1380a0.0753a0.0124bB*13∶XX/B130.11290.09160.0146b0.0790b0.0106b0.0312bB*40∶XX/B600.13280.0024b0.0536b0.1040b0.0106b0.0004bB*46∶XX/B460.14890.14720.0477b0.1320NT0.0478b

与广西壮族比较，aP<0.05,bP<0.01

注：NT为未检测

3 讨 论

随着白血病和恶性肿瘤大剂量化疗的应用，以及造血干细胞移植的大量开展，临床上需要血小板输注的患者日益增多。但是患者在多次输注血小板后可产生血小板抗体而引起同种异体免疫，导致PTR[12]。通过对某地区人群HLA基因频率和单倍型频率的分析，可掌握该地区人群中HLA基因分布情况，为临床上PTR患者筛选并提供相匹配的血小板制品，提高血小板输注的安全性和有效性。

本研究参考国内其他实验室的做法[3- 4,13]，主要是使用无偿血小板捐献者作为资料库的主要来源。虽然这种做法建库成本比较高，但是因为无偿血小板捐献者的积极性比较高，在需要其捐献血小板时，一般不会拒绝，这样可以更好地服务于临床。本研究对广西地区575名血小板捐献者(172名壮族和403名汉族)进行HLA- A、HLA- B基因分型并分析，壮族的两个位点均符合Hardy- Weinberg遗传平衡(P>0.05)，汉族的两个位点不论是否包含罕见型等位基因(其等位基因个数少于3个)时，两个位点都不符合Hardy- Weinberg平衡检验(P<0.05)。这可能是由于广西汉族与其他民族通婚的结果，或者是由于广西汉族中存在潜在的人群结构，其原因需要进一步的研究来验证[14]。

广西地区壮族血小板捐献者HLA- A、HLA- B基因频率在前5位的等位基因共占该位点基因频率的97.39%与61.34%，广西地区汉族血小板供者HLA- A、HLA- B基因频率在前5位的等位基因共占该位点基因频率的91.57%与56.83%，但等位基因A*36、A*43、A*80、B*41、B*42、B*47、B*53、B*73、B*78、B*82和B*83等在广西壮族和汉族中均没有发现。据报道，这些等位基因在部分少数民族并不少见，比如A*36在土族人群的基因频率约为1%，B*73在维吾尔族的基因频率约为2%[15]。由于HLA等位基因复杂的多态性，本实验数据相对较少，是否表现本地区真实的HLA等位基因分布情况，需加大样本量进行进一步的验证。

表7广西地区壮族和汉族血小板捐献者2个位点单倍型及频率表(频率>0.01)

单倍型广西壮族频率(n=172)单倍型广西汉族频率(n=403)A*02∶XX-B*46∶XX0.1129A*02∶XX-B*46∶XX0.0967A*11∶XX-B*15∶XX0.1090A*11∶XX-B*15∶XX0.0859A*33∶XX-B*58∶XX0.0694A*33∶XX-B*58∶XX0.0680A*11∶XX-B*13∶XX0.0645A*11∶XX-B*40∶XX0.0559A*02∶XX-B*40∶XX0.0603A*11∶XX-B*13∶XX0.0494A*02∶XX-B*15∶XX0.0560A*02∶XX-B*40∶XX0.0413A*11∶XX-B*40∶XX0.0497A*02∶XX-B*15∶XX0.0337A*02∶XX-B*38∶XX0.0471A*24∶XX-B*40∶XX0.0336A*11∶XX-B*46∶XX0.0283A*11∶XX-B*46∶XX0.0299A*24∶XX-B*13∶XX0.0245A*24∶XX-B*15∶XX0.0286A*02∶XX-B*13∶XX0.0244A*02∶XX-B*38∶XX0.0266A*02∶XX-B*55∶XX0.0220A*02∶XX-B*13∶XX0.0217A*11∶XX-B*51∶XX0.0216A*11∶XX-B*51∶XX0.0205A*24∶XX-B*55∶XX0.0196A*11∶XX-B*38∶XX0.0199A*24∶XX-B*46∶XX0.0187A*24∶XX-B*13∶XX0.0195A*24∶XX-B*40∶XX0.0179A*11∶XX-B*55∶XX0.0161A*11∶XX-B*38∶XX0.0149A*30∶XX-B*13∶XX0.0160A*11∶XX-B*54∶XX0.0144A*02∶XX-B*55∶XX0.0147A*24∶XX-B*15∶XX0.0123A*24∶XX-B*46∶XX0.0132A*11∶XX-B*56∶XX0.0117A*02∶XX-B*48∶XX0.0111A*11∶XX-B*55∶XX0.0106A*02∶XX-B*51∶XX0.0111A*02∶XX-B*56∶XX0.0103A*33∶XX-B*40∶XX0.0107

中国汉族主要分为北方汉族和南方汉族，广西地区壮族和汉族血小板捐献者常见基因频率(>0.1)与其他种族、群体比较可见，广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA基因多态性比较接近中国南方汉族，在一定程度上又具有本地区的特点。这可能是由于广西壮族和汉族与中国南方汉族具有相似的地理和历史特征所形成。据报道，中国南方汉族与中国南方少数民族有比较密切的关系，这可能是由于历史上南方汉族人群的大量增长后，其与南方少数民族在文化、地理和基因方面的融合导致[14- 16]。

在广西壮族和汉族血小板捐献者中，不仅发现一些常见的等位基因组成的单倍型有较高的频率，比如A*02∶XX- B*46∶XX、A*11∶XX- B*15∶XX和A*33∶XX- B*58∶XX，同时也发现一些不常见的等位基因组成的单倍型有较高的频率，比如在壮族中发现的A*11∶XX- B*54∶XX(0.014 4)和在汉族中发现的A*02∶XX- B*51∶XX(0.1111)。我们的结果与浙江汉族的研究结果比较相似，这些高频率或低频率的单倍型的出现，可能与选择性的压力有一定关联[16]。

根据血小板供者库最少规模估算，若一个群体的单倍型频率较高，一个150人的库就可以满足大部分人的选择要求。但据报道，不同遗传背景的患者在同一血小板供者库中找到配合性供者的概率差别很大，一个5 000人的血小板供者库，才有约80%的患者可以在其中找到5个A级配合的供者[6]，若再结合ABO同型输注的要求，供者库的规模需要更大。因此血小板供者库的建立要因地制宜，根据当地人群HLA分布频率建立本地区供者库，可主要满足本地患者需要。

研究发现，实时监测肾综合征出血热患者的血小板参数有利于对患者疾病状态作出判断，也可以用于指导临床治疗[17]；患者血小板淋巴细胞比值和中性粒细胞比值在病毒性肝脏疾病的进展、预后中有着一定的指示作用[18]。当患者输注血小板捐献者的血小板后，检测其血小板的指标是否对临床有上述指导意义，需进一步研究。本研究在国内首次初步分析总结了广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA基因频率和单倍型频率的特点，掌握该地域人群中HLA基因分布情况，可为临床提供HLA匹配的血小板制品，节约血小板，降低免疫性PTR的发生，进一步提高临床输注血小板的安全性、有效性。该结果也将会对骨髓移植病人寻找匹配的HLA供者提供帮助，同时对人类遗传学和疾病相关研究提供有用的信息。

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ThepolymorphismstudyofplateletdonorregistrywithknownHLAtypinginZhuangandHanpopulationsinGuangxiarea

PEIYong-feng,LIHeng-cong,HENing-yu,HUANGHui-ni

(NanningInstituteofTransfusionMedicine,NanningBloodCenter,Nanning530007,China)

Objective: In order to resolve the platelet transfusion refractoriness (PTR), we established a voluntary apheresis platelet donor registry in the Guangxi Zhuang and Han population who live in Guangxi, then investigated the allele and haplotype frequencies of HLA- A, and - B loci.MethodsThe blood sample of 172 Zhuang and 403 Han regular apheresis platelet donors in Guangxi region were genotyped by PCR- SSOP.ResultsThePvalues of the HLA- A and HLA- B loci showed that the HLA allelic distribution in Guangxi Zhuang population was in accordance with Hardy- Weinberg equilibrium (P>0.05), a total of 11 HLA- A alleles, 24 HLA- B alleles and 58 A- B haplotypes were identified. ThePvalues of the HLA- A and HLA- B loci showed that the HLA allelic distribution in Guangxi Han population was not in accordance with Hardy- Weinberg equilibrium (P<0.05), a total of 14 HLA- A alleles, 30 HLA- B alleles and 100 A- B haplotypes were identified.ConclusionThe Guangxi Zhuang and Han population of platelet donor registry was genetically close to southern Chinese populations, but it still keeps its unique genetic characteristics, which can rapidly find compatible donors for patients with PTR.

platelet donor; human leukocyte antigen; gene frequency; haplotype; Guangxi Zhuang population; Guangxi Han population

2016- 11- 22

2017- 06- 22

南宁市科学研究与技术开发计划项目(201003048C- 3)

裴永峰(1977-)，男，山西大同人，助理研究员，医学硕士。E- mail: 389441556@qq.com

裴永峰，李恒聪，何宁宇，等. 广西地区壮族和汉族血小板捐献者HLA基因多态性的初步分析[J].东南大学学报:医学版,2017,36(5)：686- 692.

R392.2

A

1671- 6264(2017)05- 0686- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.002

(本文编辑：何彦梅)