川芎血清药物化学成分研究

李静静，杨会鸽，范菲，刘金宝

（1.西安市食品药品检验所,陕西西安，710054;2.黑龙江省医院南岗院区，黑龙江哈尔滨，150001）

技术交流Technical Exchange

川芎血清药物化学成分研究

李静静1，杨会鸽1，范菲1，刘金宝2

（1.西安市食品药品检验所,陕西西安，710054;2.黑龙江省医院南岗院区，黑龙江哈尔滨，150001）

通过药物化学手段研究川芎的血清移行成分，以期为本药品的有效成分鉴定、提取及用药提供指导。制备对照组溶液及川芎灌胃液，建立大鼠模型，灌胃后提取血清，建立HPLC指纹图谱，并鉴定血中移行成分。本次共检出11个成分，其中4个成分属于血清，川芎提取液灌胃后从血中发现了7个入血成分，其中4个为代谢产物，3个为原型成分。川芎入血成分主要为川芎嗪和阿魏酸，可为阐明川芎药理作用及其质量控制提供依据。

川芎；血清药物化学；指纹图谱；高效液相色谱

前言

川芎是伞形科植物，川芎的根茎部分，早在《左传》已有记载，《神农本草经》始作为药物应用于临床[1]。本品苦温，味辛，多产于四川、云南等地，为“血中之气药”，有行气活血、止痛燥湿等功效[2]。本品辛香走窜，兼活血化瘀之功，因而既可行气，又擅活血，不但是治疗头痛的良药，还可入血海而调经，是妇科良药[3]。现代医学研究证实，本品的活性成分主要为川芎嗪及阿魏酸[4]。由于中药多为口服给药，通过消化吸收入血而发挥药效,因而真正进入血清的药物成分才是真正发挥药效的物质[5]。为深入探讨川芎的有效成分，我们采用药物化学的研究方法，对川芎口服后的血清成分进行分析，以期对川芎的主要药效物质进行初步揭示。

1 实验部分

1.1 试剂及药品

川芎嗪(批号200305)、阿魏酸对照品(批号200611)由中国食品药品检定研究院提供；乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸水，磷酸为分析纯。川芎购自同仁堂有限责任公司，经本院专家鉴定，符合《中国药典》（2010年版）[6]规定。

1.2 仪器

日本岛津公司生产的LC-20AT高效液相色谱仪；美国OHAUS仪器有限公司生产的AR140·C型电子天平及LC solution工作站；昆山市超声仪器有限公司生产的KQ-500E超声波清洗器；上海精宏实验设备有限公司生产的DZF-6050型真空干燥箱。

1.3 实验方法

1.3.1 制备对照组溶液及川芎灌胃液

分别取适量川芎嗪和阿魏酸，以甲醇定容至10 mL，再予以超声10min作为对照品。川芎与95%乙醇1∶10回流提取2h，过滤并浓缩至0.5g/mL，再取1mL加甲醇稀释至10mL，过滤后76℃下干燥24h，得川芎浸膏，溶于100mL水中作为灌胃液。

1.3.2 制备血清

本研究所采用的SD大鼠购于本校实验动物中心，体重（200±20）g，随机分为两组。观察组予以2 mL川芎灌胃，1次/d，连续给药7d；对照组给予等量蒸馏水灌胃。于末次给药0.5，1h后从眼眶取血，37℃水浴静置24h，离心20min，取上清液。血清加入甲醇，超声20min，沉淀除去蛋白，离心后取上清液，过滤后供HPLC分析。

1.3.3 血清指纹图谱测定

色谱柱：Kromasil C18色谱柱（4.6mm× 150mm，5μm）；流动相：A（0.05%磷酸）-B（乙腈）梯度洗脱，具体见表1；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长203nm；进样量10μL。取供试品及对照品溶液，按照上述条件，注入液相色谱仪，得到色谱图。

表1 梯度洗脱程序Table1 The gradient elution program

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 精密度

同一溶液连续进样6次，记录色谱图。

1.3.4.2 稳定性

同一溶液分别于0h，2h，4h，8h，12h，24h进样，记录色谱图。

1.3.4.3 重复性

同一批血样，制备6份供试液，进样，记录色谱图。

2 结果与讨论

2.1 色谱图

根据色谱条件所得的空白血样、空白血样+对照品、川芎血样色谱图见图1、2、3、4、5。

图1 空白血样HPLCFig.1 The HPLC of blank blood sample

图2 白血样+对照品HPLC 1.川芎嗪;2.阿魏酸Fig.2 The HPLC of blank blood sample and reference substance 1.ligustrazine;2.ferulic acid

图3 川芎血样HPLC（30min取血）1.川芎嗪;2.阿魏酸Fig.3 The HPLC of blood sample of ligusticum wallichii（blood is taken at 30min）1.ligustrazine;2.ferulic acid

图4 川芎血样HPLC（60min取血）1.川芎嗪;2.阿魏酸Fig.4 The HPLC of blood sample of ligusticum wallichii（blood is taken at 60min）1.ligustrazine;2.ferulic acid

图5 川芎提取液体外HPLC 1.川芎嗪;2.阿魏酸Fig.5 The external HPLC of the extraction liquid of ligusticum wallichii 1.ligustrazine;2.ferulic acid

2.2 方法学考察结果

同一溶液连续进样6次，结果各共有特征色谱峰相对保留时间的RSD均＜1%，相对峰面积的RSD均＜3%，表明供试品进样精密度良好；同一溶液分别于0h，2h，4h，8h，12h，24h进样，结果各共有特征色谱峰相对保留时间的RSD＜1%，相对峰面积的RSD＜3%，表明供试品稳定性良好；同一批血样，制备6份供试液，进样，结果各共有峰相对保留时间的RSD＜1%，相对峰面积的RSD＜3%，表明本测定方法重复性良好。

2.3 血清指纹图谱

根据峰数、峰面积积分值等相关参数确定共有指纹峰，选取特征指纹峰群建立川芎血清指纹图谱，通过对所得色谱图进行分析发现，川芎血样中有11个色谱峰，其中1、2、4号峰属于血清，3、5号峰分别为川芎嗪与阿魏酸；6号峰为蛋白峰，系血清残留成分；7号峰属于未知的药物成分；与空白+对照品血样比较，8、9、10、11号峰是新出现的，推测为川芎的代谢产物。见图6。

图6 川芎的血清指纹图谱Fig.6 The serum fingerprint of ligusticum wallichii

2.7 表观血清指纹图谱

基于上述结果，对川芎提取液HPLC指纹图谱中与血清移行成分相关的特征指纹峰进行标定，获得表观血清指纹图谱，见图7。该图谱可表达血中移行成分。

图7 川芎HPLC表观血清指纹图谱Fig.7 The apparent serum fingerprint of ligusticum wallichii

3 结论

由于中药材的药效与产地、炮制方法等密切相关，因而其质量控制是科研的重要环节，也是近年来研究的重点[7]。随着血清药物化学在中医药领域的应用，指纹图谱质控技术越来越受到学者们的重视，在中药材的药效评价方面占据了重要地位[8]。

本研究中，我们对川芎的血清药物化学进行了探讨，通过对不同取血时间的血样进行比较发现，30min色谱图中多数成分的峰面积要大于1h血样，因而，末次给药后30min采集血样为佳。本次共检出11个成分，其中2个为已知的药物有效成分，4个成分属于血清，其余成分可能为代谢产物。川芎嗪、阿魏酸作为川芎的主要成分，均可从血清中检出，说明是药物通过消化系统吸收入血的有效成分，可用于评价川芎的药效，并可作为衡量药物品质的指标。川芎的表观血清HPLC指纹图谱包含较多该药材血中移行成分的信息，与既往单一成分指标相比，能更好地控制中药的质量，也可避免直接用血清指纹图谱作为评价指标所带来的操作不便、费用高、耗时多等问题[9～11]。

由于中药材成分较为复杂，品种繁多，因而一直以来缺乏明确的质量标准，这对规范中药市场、中医药现代化及国际化都造成了一定程度的阻碍[12～13]。指纹图谱可全面客观地反应药材的化学成分，并分析探讨其内在特征，予以定量分析，这对于建立完善的中药质控体系至关重要。

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Study on Chemical Constituents of Serum from Ligusticum Wallichii

LI Jing-jing,1YANG Hui-ge1，FAN Fei1and LIU Jin-bao2
（1.Xi'an Institute for Food and Drug Control,Xi’an 710054,China;2.Nan gang Hospital.of Hij Province Hospital Department of Radiology,150001 China)

In order to provide guidance for the identification,extraction and administration of the active ingredients of ligusticum wallichii,its serum migration is studied by means of drug chemistry.The control group solution and the filling liquid of ligusticum wallichii are prepared,the rat model is established and the serum is extracted after intragastric administration.The HPLC fingerprints are built and the migration composites are identified.A total of 11 composites are identified,of which 4 are serum.After the intragastric administration of ligusticum wallichii,there are 7 blood samples are found from the blood,4 of them are metabolites and the other 3 are the prototype composites.It is indicated that the main composites which enter into the blood of ligusticum wallichii are composed of ligustrazine and ferulic acid,which can provide a basis for clarifying the pharmacological effects of ligusticum wallichii and its quality control.

Ligusticum wallichii;serum pharmacochemistry;fingerprint;high performance liquid chromatography

R 284.1

B

1001-0017（2017）04-0307-03

2017-03-12

李静静（1984-），女，陕西西安人，硕士，主管药师，主要研究方向为药物分析。