响应曲面法优化微生物降解长焰煤工艺条件

李建涛，刘向荣，王 静，徐云龙

(1.西安科技大学化学与化工学院，陕西 西安 710054；2.商洛学院化学工程与现代材料学院，陕西 商洛 726000)

响应曲面法优化微生物降解长焰煤工艺条件

李建涛1,2，刘向荣1*，王 静1，徐云龙1

(1.西安科技大学化学与化工学院，陕西 西安 710054；2.商洛学院化学工程与现代材料学院，陕西 商洛 726000)

选择4种细菌降解宝鸡麟游长焰煤，通过菌-煤匹配降解实验筛选出优势降解菌；在单因素实验的基础上，以接种量(A)、氧化程度(B)、降解时间(C)为自变量，以降解转化率为响应值，采用响应曲面法对多粘类芽孢杆菌降解长焰煤的工艺条件进行了优化研究。结果表明，优势降解菌为多粘类芽孢杆菌；影响降解转化率的多元二次方程模型为η=45.22+5.75A+10.24B+16.64C+5.43AC+5.35BC-7.84A2-9.67B2-13.02C2，R2=0.9779，失拟值为0.1565，失拟误差不显著；氧化程度和降解时间对降解转化率影响非常显著，接种量影响不显著，3个因素间的交互作用影响不显著；接种量、氧化程度、降解时间的最佳值分别为7.08 mL·(50 mL)-1、7.58 mol·L-1、9.84 d，对应的最大降解转化率为 59.14%，在此条件下进行验证实验得到降解转化率为58.87%，与模型预测值相差较小，表明所得模型能够较好地预测实际降解效果。

长焰煤；多粘类芽孢杆菌；降解；响应曲面法

我国煤炭储量居世界第三，消费量居世界第一。我国煤炭消费量占能源总消费量的60%以上。按照我国煤阶的划分方法，低阶煤主要为褐煤、长焰煤、不粘煤、弱粘煤等，其特点是热值低，水分、灰分、腐植酸含量相对较高，侧链及含氧官能团较多，含氧量为15%～30%，不适合直接作为燃料，而现有技术大多不能清洁高效地利用低阶煤资源，易造成资源浪费和环境污染[1-4]。由于低阶煤含有丰富的类木质素结构，分子中的侧链、桥键、活性官能团较多，使得低阶煤易于被微生物降解。微生物降解是一种清洁利用低阶煤的新技术，其条件温和、能耗低、污染小，降解所得产物可用于工业、农业、医学等多个领域[5-7]。我国低阶煤储量占比高达55%[8]，因此，利用微生物降解低阶煤具有极大的优越性和广阔的前景，受到研究人员的高度重视与关注。

鉴于此，作者选择4种具有煤炭降解能力的细菌，用于降解宝鸡麟游长焰煤，旨在确定菌-煤匹配关系，并通过响应曲面法对优势菌降解宝鸡麟游长焰煤的工艺条件进行优化，以获得最佳降解工艺条件和模型方程，并对降解过程影响因素的显著性进行评价。

1 实验

1.1 材料、菌种与培养基

宝鸡麟游长焰煤原煤，水分6.96%、灰分12.78%、挥发分 45.65%、固定碳34.61%，元素分析：C 64.50%、H 8.15%、O 12.67%、N 0.82%、 S 1.08%，属低灰分、高挥发分、中低固定碳煤；C、H含量较低，O含量较高，为低变质程度煤。原煤经破碎、球磨、过筛制得粒径分别为1 700～2 360 μm、880～1 700 μm、550～880 μm的煤样，备用。

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，中国工业微生物菌种保藏管理中心；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)，中国普通微生物菌种保藏管理中心。

牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1.0 L，自然pH值6.62。

驯化培养基Ⅰ：牛肉蛋白胨培养基的基础上加1.0 g硝酸氧化的长焰煤，自然pH值6.72。

驯化培养基Ⅱ：牛肉蛋白胨培养基的基础上加2.0 g硝酸氧化的长焰煤，自然pH值6.86。

1.2 煤样的预处理

分别用4 mol·L-1、6 mol·L-1、8 mol·L-1的硝酸将3种粒径煤样按煤样质量与硝酸体积比1.0∶2.5(g∶mL)的比例搅拌均匀，浸泡氧化24 h，抽滤，用去离子水冲洗至滤液pH值为7左右，烘干，于121 ℃、0.1 MPa高压灭菌20 min，备用[9-11]。为了利于实际作业，本实验以硝酸浓度表示煤样的氧化程度。

1.3 细菌的复活及驯化

复活：煤样、所用仪器全部灭菌。取4支试管，各装入10 mL牛肉蛋白胨培养基，分别接入苏云金芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，接好菌的试管置于28 ℃恒温培养箱中160 r·min-1振荡培养48 h[12]。

驯化：将复活的4种细菌分别接种到盛有10 mL驯化培养基Ⅰ的4支试管中，于28 ℃恒温培养箱中160 r·min-1振荡培养48 h；再将一代驯化细菌分别接种到盛有10 mL驯化培养基Ⅱ的4支试管中，于28 ℃恒温培养箱中160 r·min-1振荡培养48 h，备用。

1.4 优势降解菌的筛选

取12支试管，分为4组，每支试管均加入氧化程度为8 mol·L-1、粒径为1 700～2 360 μm的长焰煤样0.1000 g，灭菌；调节4种驯化菌液浓度为5×105CFU·mL-1；分别在4组试管中加入4种菌液各10 mL；另取3支试管，加入10 mL培养基和等量灭菌的煤样，作为空白对照。将5组试管置于恒温培养箱中，于28 ℃、160 r·min-1振荡培养14 d；抽滤于锥形瓶中，加入玻璃珠和适量去离子水高速搅拌，使菌丝体和煤样充分分离；离心，去除漂浮菌丝体的上层液体，过滤；滤渣加适量去离子水搅拌，离心，去除漂浮菌丝体的上层液体，如此反复直至菌丝体去除干净；烘干，称重，按式(1)[13-14]计算降解转化率(η)，取平均值。以降解转化率最大者为优势降解菌，用于后续实验。

(1)

式中：m为煤样的初始质量，g；m1为降解后残余煤渣质量，g。

1.5 优势菌降解长焰煤工艺优化

1.5.1 单因素实验

以筛选得到的优势菌按1.4方法降解长焰煤，以降解转化率为考核指标，以煤样粒径、氧化程度、煤浆浓度、接种量、降解时间、降解温度、振荡转速为考察因素设定不同取值进行降解工艺优化单因素实验，每一个设定值做3个平行实验。

1.5.2 响应曲面法实验

在单因素实验的基础上，选择接种量、氧化程度、降解时间为自变量，以降解转化率为响应值，用Box-Behnken设计实验，用Design-Expert 8.0软件进行响应曲面分析，进一步优化微生物降解长焰煤工艺条件。

2 结果与讨论

2.1 优势降解菌的筛选结果

图1是4种细菌降解长焰煤的转化率。

图1 4种细菌降解长焰煤的转化率Fig.1 Conversion rates of long flame coal degradedby four bacteria

由图1可以看出，4种细菌都能不同程度地降解长焰煤，降解能力大小依次为：多粘类芽孢杆菌>苏云金芽孢杆菌>鼠伤寒沙门氏菌>金黄色葡萄球菌，其中，多粘类芽孢杆菌的降解能力最强。因此，选择多粘类芽孢杆菌为降解长焰煤的优势菌，用于后续实验。

2.2 单因素实验结果

单因素实验确定的多粘类芽孢杆菌降解长焰煤的工艺条件为：煤样粒径550～880 μm、氧化程度8 mol·L-1、煤浆浓度0.75 g·(50 mL)-1、接种量5 mL·(50 mL)-1、降解时间7 d、降解温度30 ℃、振荡转速180 r·min-1。

2.3 响应曲面法实验结果

2.3.1 实验方案设计

对单因素实验结果进行分析，发现煤样粒径、氧化程度、煤浆浓度、接种量和降解时间5 个因素对降解转化率影响较大，为主要影响因素。但对于煤样粒径，前期大量实验证明对一定量的煤样而言，粒径越小，降解转化率越高，原因可能是相同质量的煤样，粒径越小，表面积越大，煤样和细菌的接触面就越大，也就是说单位时间内煤样和细菌产生的溶煤物直接接触的几率越大，溶煤效果越好；但煤样过细，又会使得产物中菌丝体和细小的煤样粘附在一起难以分离，导致通过式(1)计算的降解转化率失真，不能用式(1)定量评判细菌对长焰煤的降解效果。另外，煤浆浓度和煤样粒径紧密相关，故仅对接种量、氧化程度和降解时间进行响应曲面法优化，其它因素按单因素实验确定的工艺条件取值。

2.3.2 Box-Behnken设计实验结果与分析

以接种量、氧化程度和降解时间为自变量，以降解转化率为响应值，用Box-Behnken 进行实验设计，结果见表1。

表1Box-Behnken设计实验结果

Tab.1Results of Box-Behnken design experiment

由表1可知，3个因素对降解转化率均有显著影响。因此，研究各因素水平的最佳组合，进而建立降解转化率的预测模型具有实际意义。

根据表1数据，利用 Design-Expert 8.0 软件进行响应曲面分析，得到降解转化率与各因素间多种模型的方差分析及R2的综合分析，结果见表2和表3。

由表2、3可知，经F检验，软件系统给出如下模型：线性、双因素、二次和三次方程，其中，以二次方程模型为最适模型。对回归二次方程模型方差来源与显著性进行分析，结果见表4。

表2多种模型的方差分析

Tab.2Variance analysis for models

表3模型综合分析

Tab.3Model summary statistics

表4回归二次方程模型方差来源与显著性分析

Tab.4Variance source and significant

注：＊＊表示非常显著(P<0.001)，＊表示不显著(P>0.001)。

在二次方程模型中，因素A(接种量)对响应值η的影响不显著；因素B(氧化程度)对响应值η的影响非常显著；因素C(降解时间)对响应值η的影响非常显著；二次项C2对响应值η的影响非常显著，而A2、B2对响应值η影响不显著；交互项AB、AC、BC对响应值η的影响均不显著，且由于AB的交互作用对η的影响甚微，软件没有给出分析数据。

2.3.3 拟合模型的建立

根据以上分析，对多元二次方程进行回归拟合，建立模型方程为：η=45.22+5.75A+10.24B+16.64C+5.43AC+5.35BC-7.84A2-9.67B2-13.02C2。

图2为煤样降解转化率标准曲线残差概率与内学生化残差概率的拟合曲线。

图2 煤样降解转化率标准曲线残差概率与内学生化残差概率的拟合曲线Fig.2 Fitted curve of normal probability and internallystudentized residual for degradation conversion rateof long flame coal

由图2可以看出，标准曲线具有较好的拟合性，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。

2.3.4 交互作用分析

利用Design-Expert 8.0软件对回归模型进行响应曲面分析，得到3个因素间交互作用关系的等值线与响应面，如图3所示。由于接种量和氧化程度之间的交互作用甚微，软件没有给出二者之间的等值线图和响应面图。

由图3可直观地看出，接种量、氧化程度和降解时间之间的交互作用不显著。

2.3.5 最优工艺验证

软件给出了43种可能的组合方式，最大响应值(59.14%)时接种量、氧化程度、降解时间的最佳值为：7.08 mL·(50 mL)-1、7.58 mol·L-1、9.84 d。在该条件下进行验证实验，得到的降解转化率为58.87%，与预测值相差较小，表明该模型可较好地预测实际降解效果。

图3 三因素交互作用的等值线与响应面Fig.3 Contour and response surface of the interaction among three factors

3 结论

选择4种具有煤炭降解能力的细菌降解长焰煤，通过菌-煤匹配降解实验确定优势菌为多粘类芽孢杆菌；在单因素实验的基础上，利用 Box-Behnken设计响应曲面法实验，拟合得到影响多粘类芽孢杆菌降解长焰煤转化率的多元二次回归方程模型为：η=45.22+5.75A+10.24B+16.64C+5.43AC+5.35BC-7.84A2-9.67B2-13.02C2。氧化程度(B)和降解时间(C)对降解转化率的影响均非常显著，接种量(A)影响不显著。确定多粘类芽孢杆菌降解宝鸡麟游长焰煤的最佳条件为：接种量7.08 mL·(50 mL)-1、氧化程度7.58 mol·L-1、降解时间9.84 d、煤样粒径550～880 μm、煤浆浓度0.75 g·(50 mL)-1、降解温度30 ℃、振荡转速180 r·min-1，在此条件下，降解转化率可达59.14%。验证实验所得实际降解转化率为58.87%，与模型预测值相差较小，表明所建立模型可较好预测实际降解效果。

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ProcessOptimizationinMicrodegradationofLongFlameCoalbyResponseSurfaceMethodology

LI Jian-tao1,2,LIU Xiang-rong1*,WANG Jing1,XU Yun-long1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,Xi′anUniversityofScienceandTechnology,Xi′an710054,China;2.CollegeofChemicalEngineeringandModernMaterials,
ShangluoUniversity,Shangluo726000,China)

We screened a superior strain from four bacteria by degradation matching experiments of Baoji Linyou long flame coal.Based on single-factor experiment,using inoculum(A),oxidation degree(B),and degradation time(C) as variables,the degradation conversion rate as responsible value,we optimized the degradation conditions of long flame coal withPaenibacilluspolymyxaby response surface methodology.The results indicated that the superior strain wasPaenibacilluspolymyxa,the multi-quadratic equation model wasη=45.22+5.75A+10.24B+16.64C+5.43AC+5.35BC-7.84A2-9.67B2-13.02C2,R2=0.9779,and the lack of fit was 0.1565,not significant.Meanwhile,we found the oxidation degree and degradation time were the significant factors for the degradation conversion rate,but inoculum and the interactions among three factors were not significant.The optimum values of inoculum,oxidation degree,and degradation time were 7.08 mL·(50 mL)-1,7.58 mol·L-1,and 9.84 d,respectively,while the corresponding degradation conversion rate was 59.14%.Under the optimum conditions,the degradation conversion rate of verification experiment was 58.87%,which was slightly different from the predicted value,furthermore,the obtained model was able to predict practical situation.

long flame coal;Paenibacilluspolymyxa;degradation;response surface methodology

TQ536.9 TD984

A

1672-5425(2017)10-0032-05

国家自然科学基金项目(21373158)，陕西省科技厅中澳合作项目(2013KW17)

2017-05-15

李建涛(1979-)，男，陕西商州人，讲师，博士，研究方向：煤的转化和综合利用，E-mail:287652734@qq.com；通讯作者：刘向荣，教授，E-mail：liuxiangrongxk@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.007

李建涛，刘向荣，王静，等.响应曲面法优化微生物降解长焰煤工艺条件[J].化学与生物工程，2017，34(10)：32-36.