固定化细胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯工艺研究

陈孝鹏，沈 炜，王亚军

浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江工业大学生物工程学院，浙江 杭州 310032

固定化细胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯工艺研究

陈孝鹏，沈 炜，王亚军

浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江工业大学生物工程学院，浙江 杭州 310032

采用硅藻土作载体，聚乙烯亚胺和戊二醛作交联剂来固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr共表达菌株，以此来催化 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成 6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2]，考察了硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化细胞的催化性能，进一步优化了固定化细胞催化合成(3R,5R)-2工艺。结果表明：在固定化细胞用量100 g/L、葡萄糖与底物质量浓度比为1:1、转化温度30℃、pH 7.0、流速12 mL/min、100 g/L的(5R)-1转化完全的条件下，填充床式反应器可以连续反应五个批次，转化570 g/L的(5R)-1，较搅拌式反应器提高了107.3%，较游离细胞间歇催化操作提高了185%。

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯 羰基还原酶 固定化

阿托伐他汀钙是一种对胆固醇合成中关键性限速酶 HMG-CoA还原酶具有强烈的竞争性抑制作用的药物，能有效地降低胆固醇的含量，降低心血管疾病的风险[1]。6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2]是阿托伐他汀钙合成的重要手性砌块[2]。相较于化学合成法的苛刻反应条件，生物法合成手性药物具有明显的优势，其立体选择性高、反应条件温和、对生产设备的要求低，大大降低了生产成本[3,4]。

羰基还原酶是一类能够不对称催化前手性酮还原为光学醇的酶[5]。肖黎等[6]构建了羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶共表达菌株E. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr，开发了双酶共表达菌株全细胞催化 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成(3R,5R)-2的工艺(图 1)，游离E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr全细胞最高可以催化200 g/L (5R)-1完全转化，产物差向异构体过量(d.e.p)值大于99.5%。但游离细胞催化工艺的酶和辅酶只能使用一次，存在转化液容易乳化、下游分离难度大等缺陷[7,8]。

图1 共表达菌株催化合成(3R,5R)-2Fig.1 Schematic illustration of (5R)-1 bioreduction to (3R,5R)-2 synthesis catalyzed by E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr

针对游离细胞催化工艺的缺陷，本研究选择硅藻土作为载体，采用交联剂聚乙烯亚胺和戊二醛固定E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞，考察了固定化细胞的催化性能，进一步优化了固定化细胞催化合成(3R,5R)-2工艺。

1 材料与方法

1.1 实验材料

E. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr，由浙江工业大学生物工程研究所构建[6]、保藏；(5R)-1（质量含量约68%）由浙江新东港药业股份有限公司馈赠；(3R,5R)-2购自Toronto Research Chemicals Inc.（多伦多，加拿大）；卡那霉素购自TaKaRa公司；50%聚乙烯亚胺购自上海晶纯生化科技股份有限公司；25%戊二醛购自天津阿法埃莎化学有限公司；硅藻土购自温州化学材料厂；其它试剂均为市售分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

种子液培养：从斜面培养基中挑取一接种环的菌落接种于装有100 mL种子培养基的500 mL摇瓶中，摇瓶置于旋转式摇床在37 ℃、180 r/min下培养8～10 h。

罐上发酵培养：种子37 ℃下培养8～10 h后，按3.0% (v/v)的接种量接种于装有3 L发酵培养基的5 L发酵罐中，37 ℃、500 r/min、通气量4 L/min、溶氧40%的条件下培养2 h左右，加入终浓度为15 g/L乳糖，28 ℃诱导表达12 h。将发酵液在8 000 r/min下离心10 min，弃上清液，菌体用生理盐水洗涤两次后-20 ℃保藏。

1.2.2 硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化细胞制备

称取约10 g湿菌体（细胞干重2.0 g），重新悬浮于100 mL、pH7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中；加入0. 6 g硅藻土，搅拌0.5 h后加入4 mL 10%聚乙烯亚胺溶液（预先用稀盐酸调至pH7.0），交联1 h；再加入1 mL的50%戊二醛溶液，交联1 h后抽滤，用缓冲液洗涤三次后4 ℃保藏。

1.2.3 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯转化

取10 g硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr，加入到100 mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，葡萄糖与底物以质量比1:1添加，加入5 g (5R)-1，在30 ℃的水浴中反应。待反应结束，取样用无水乙醇稀释，高效液相色谱检测产物。

1.2.4 填充床连续转化

称取40 g硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr，填充至填充床反应器中。反应器底端有泡沫滤芯，防止固定化细胞在底部泄露（图 2）。填充柱内部封闭，400 mL反应液（由360 mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液构成，含有40 g葡萄糖和40 g (5R)-1）通过蠕动泵从上端泵入，流经固定化细胞反应后，从底部流出，回到储藏反应液的烧杯中，通过烧杯中搅拌子的搅动使反应液混合均匀，然后再通过蠕动泵泵回到反应器。填充柱外部有一层夹套，通入30 ℃温水保持反应器温度在30 ℃左右。

图2 固定化细胞填充床反应器Fig.2 Packed bed bioreactor with the immobilized E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr 1-immobilized cells, 2-pump1, 3-mixture, 4-water, 5-pump2

1.3 分析方法

(5R)-1、(3R,5R)-2采用岛津HPLC LC-20AD高效液相色谱仪检测。色谱柱为J&K CHEMICA®C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相由体积比1:3 (v/v)的乙腈水溶液组成，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长设置为210 nm，柱温40 ℃。产物(3R,5R)-2的d.e.p值按式（1）计算。

式中，c(3R,5R)-2表示产物(3R,5R)-2的浓度，mol/L；c(3S,5R)-2表示差向异构体(3S,5R)-2的浓度，mol/L。

定义30 ℃、pH 7.0条件下每分钟催化生成1 μmol (3R,5R)-2所需要的酶量为1 U，则固定化细胞剩余酶活r为反应结束后固定化细胞酶活（A，U/g）与初始固定化细胞酶活（A0，U/g）的比值。

2 结果与讨论

2.1 反应体系pH对反应的影响

反应pH对硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞催化(5R)-1不对称还原反应的影响示于图3。当pH为6.5～7.5时，转化率达到95%以上；在pH7.0下反应3 h后，固定化细胞剩余酶活最高，酶活损失不大。其它pH条件下固定化细胞的剩余酶活较低，过酸过碱条件都不利于酶发挥催化活性。在考察pH范围内其d.e.p都在99.5%以上，表明pH值不改变固定化细胞羰基还原酶的立体选择性。因此，确定pH7.0为固定化细胞的最适反应pH。

图3 体系pH值对不对称还原反应的影响Fig.3 Effect of solution pH on (5R)-1 asymmetric reduction

图4 温度对不对称还原反应的影响Fig.4 Effect of temperature on (5R)-1 asymmetric reduction

2.2 反应体系温度对反应的影响

反应温度对硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞催化(5R)-1不对称还原反应的影响示于图4。在25～28 ℃和35 ℃下反应3 h，(5R)-1不能完全转化；30～32 ℃下反应3 h (5R)-1能完全转化完。较低温度下，固定化细胞的反应速度较慢；当温度高于30℃时固定化细胞酶活损失较大。在考察温度范围内产物d.e.p都在99.5%以上，表明温度不影响羰基还原酶的立体选择性。因此，确定30 ℃为固定化细胞的反应温度。

2.3 反应体系葡萄糖浓度对反应的影响

葡萄糖与底物的质量比对硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞催化(5R)-1不对称还原反应的影响示于图 5。当葡萄糖浓度与底物质量比≤1:2 (w/w)时，(5R)-1转化率较低，葡萄糖的氧化成为了限速步骤。当葡萄糖与底物质量比≥1:1时，(5R)-1能够完全反应，高浓度的葡萄糖对固定化细胞活性没有明显抑制作用，(3R,5R)-2的d.e.p值保持在99.5%以上。从经济的角度来考虑，确定1:1为硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞的最适葡萄糖与底物质量比。

图5 葡萄糖浓度对不对称还原反应的影响Fig.5 Effect of glucose concentration on (5R)-1 asymmetric reduction

图6 底物浓度对不对称还原反应的影响Fig.6 Effect of (5R)-1 concentration on its asymmetric reduction

2.4 反应体系底物浓度对反应的影响

底物浓度对硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞催化(5R)-1不对称还原反应的影响示于图6。当(5R)-1浓度为25～50 g/L时，反应3 h后(5R)-1能完全转化。当底物浓度高于75 g/L后，反应3 h (3R,5R)-2累积浓度接近，但固定化细胞的剩余酶活随着(5R)-1浓度的增大而快速下降。这是因为底物或杂质对固定化细胞造成一定的破坏，导致酶蛋白的流失。因此，确定50 g/L为固定化细胞的最适底物浓度。

2.5 反应体系固定化细胞浓度对反应的影响

固定化细胞浓度对硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞催化(5R)-1不对称还原反应的影响示于图7。随着固定化细胞浓度的增加，相同时间内(5R)-1转化率相应的提高。此外，细胞浓度的增加可以减缓高浓度底物对固定化细胞的破坏，减缓酶活损失。但过高的细胞浓度会增加操作难度和提高细胞培养成本，100 g/L的细胞浓度后，细胞用量的增加，(5R)-1转化率增加不明显，但成本大大增加。综合考虑，确定100 g/L为硅藻土固定化细胞的最适细胞浓度。

图7 固定化细胞浓度对不对称还原反应的影响Fig.7 Effect of immobilized cell loading size on(5R)-1 asymmetric reduction

2.6 固定化细胞使用批次研究

固定化细胞的反应批次是评价其性能的一个重要指标。考察了最优条件下固定化细胞在搅拌式反应器中的反应批次，转化体系组成为90 mL pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4缓冲液（100 mM），5 g (5R)-1，5 g葡萄糖，10 g固定化细胞，反应完全后抽滤回收固定化细胞并用缓冲液冲洗两次，用于下一批次的反应，结果示于图8。结果表明，固定化细胞在搅拌式反应器中可以反应五个批次，50 g/L的(5R)-1能够完全转化，但第6个批次难以转化完全，在加入少量NADPH后反应继续进行。从反应进程曲线中可以看出每一批反应完后固定化细胞酶活下降很快，反应时间大大延长。经验证，底物中的杂质对细胞具有较大的破坏作用，杂质的存在使得细胞裂解，导致蛋白的流失，影响了反应批次。

图8 搅拌釜中(3R,5R)-2分批补料转化Fig.8 Fed-batch conversion of (3R,5R)-2 by immobilized cells in the stirred tank bioreactor

图9 填充床反应器中流速对反应的影响Fig.9 Effect of flow rate on (5R)-1 asymmetric reduction in the packed bed bioreactor

2.7 填充床反应器中物料流速对反应的影响

填充床反应器中物料流速对产物浓度的影响示于图9。当流速为6～12 mL/min时，初始反应速率和转化率都随着物料的流速增大而增加。当流速继续增大至18 mL/min后，反应速率和转化率呈现出随物料流速下降的趋势，这与高流速下底物(5R)-1的停留时间下降有关[9]。因此，确定12 mL/min为填充床反应器中固定化细胞的最适物料流速。

2.8 填充床反应器中底物浓度对反应的影响

填充床反应器中底物浓度对反应的影响示于图10。由于(5R)-1溶解度不高，固定化细胞初始反应速率相差不大，随着(5R)-1的消耗，反应速率降低，直到反应结束。但当(5R)-1浓度过高，随着反应的进行，产物浓度的升高抑制了反应正向进行，出现产物抑制现象，(5R)-1浓度超过100 g/L后产物抑制现象较明显。因此，确定100 g/L为填充床反应器中固定化细胞的最适底物浓度。

图10 底物浓度对填充床反应器中不对称还原反应的影响Fig.10 Effect of (5R)-1 concentration on its asymmetric reduction in the packed bed bioreactor

2.9 填充床反应器中固定化细胞使用批次研究

填充床反应器不仅可以进行底物循环连续式反应，又可以及时的将产物分离出去，避免的产物的积累对细胞的影响。另外，填充床使得固定化细胞与反应液分离开来，避免了搅拌对固定化细胞的破坏作用，大大增加了固定化细胞的操作稳定性，降低了生产成本[10]。考察了在最适条件下，固定化细胞在填充床反应器中的反应批次。转化体系组成为：360 mL pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4缓冲液（100 mM），加入40 g (5R)-1和40 g葡萄糖，反应器中填充40 g固定化细胞，通过蠕动泵将反应液以12 mL/min的流速泵入到反应器中，在30 ℃下反应，定时取样检测是否转化完全，反应完全后用100 mL缓冲液冲洗两次，用于下一批次的反应。

填充床反应器中硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞使用批次示于图11。第1个批次100 g/L的(5R)-1在4.5 h左右能转化完全，反应速度较搅拌式反应器更快，且在转化五个批次后第六个批次还能转化70%，最终转化 570 g/L的(5R)-1，较搅拌式反应器提高了107.3%。

图11 填充床反应器中不同使用批次的细胞活性Fig.11 Continuous conversion of (5R)-1 to (3R,5R)-2 by immobilized cells in the packed bed bioreactor

3 结 论

研究了硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr细胞在搅拌式反应器和填充床反应器中的催化性能，建立了(3R,5R)-2催化合成工艺。填充床反应器的生产率最高，其最佳催化工艺为：反应温度30 ℃，反应pH7.0，葡萄糖与底物的质量比为1:1，(5R)-1浓度100 g/L，固定化细胞浓度100 g/L，流速12 mL/min。在最优条件下，570 g/L的(5R)-1在72 h内完全转化，较游离细胞催化工艺[6]提高了 185%。构建的固定床生物反应器连续生物催化合成(3R,5R)-2技术，为(3R,5R)-2规模化生产提供新的选择。

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Biocatalytic Process oft-Butyl 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxylhexanoate by Immobilized Cells

Chen Xiaopeng, Shen Wei, Wang Yajun
Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

Chiral diolt-butyl 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxyhexanoate synthetic process was established by using the celite-polyethyleneimine (PEI)-glutaraldehyde (GA) immobilizedE.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crcells in present work. The optimized batch bioconversion conditions for the celite-PEI-GA immobilizedE. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crwere as follows: 30℃, pH 7.0, 100 g/L immobilized cell loading size, 50 g/Lt-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate, mass ratio of glucose tot-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate at 1:1 (w/w). Results demonstrated that the celite-PEI-GA immobilizedE. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crcells can be reused for five intermittent batches. Further,its catalytic conditions were studied in the stirred tank bioreactor and packed bed reactor. Under the optimized biocatalytic conditions, 570 g/Lt-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate was completely converted by the celite-PEI-GA immobilized cells in 72 h in the packed-bed bioreactor, which was improved 185% and 107.3% in comparison with those of the free cells and the celite-PEI-GA immobilized cells in the stirred tank bioreactor, respectively.

t-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate; carbonyl reductase; immobilization

Q814.2; 0643.3

A

1001—7631 ( 2017 ) 03—0236—07

10.11730/j.issn.1001-7631.2017.03.0236.07

2017-04-19;

2017-05-17。

陈孝鹏（1992—），男，硕士研究生；王亚军（1975—），男，教授，通讯联系人。E-mail:wangyj@zjut.edu.cn。

国家自然科学基金（21476209）。