梯度有机负荷下农业废弃物厌氧发酵特性及微生物群落

勒系意，黄运红，任雨涵，陈柳萌



梯度有机负荷下农业废弃物厌氧发酵特性及微生物群落

勒系意1，黄运红1，任雨涵1，陈柳萌2※

（1. 江西师范大学生命科学学院，南昌 330022； 2. 江西省农业科学院农业应用微生物研究所，南昌 330200）

为了解梯度负荷对不同C/N农业废弃物厌氧发酵特性及微生物群落的影响，该试验以猪粪、金针菇菌包、稻秆和甘蔗叶等C/N差异较大的废弃物作为原料，通过逐渐提高全混合厌氧反应器（continuous stirred tank reactor, CSTR）的有机负荷率（organic loading rate，OLR），研究物料在4个OLR（1.11、1.67、2.22和2.78 g/(L∙d)，以可挥发性固体计）下的产甲烷特性和微生物群落结构变化。结果表明：4种物料的日甲烷产量均随OLR递增而增加，但单位物料甲烷产率与微生物菌群结构则因物料C/N差异而表现出不同的变化趋势。其中：猪粪的日甲烷产量最高，细菌和古菌的菌群结构与对照组相比变化不大；多样性指数先增后减，甲烷产率也在OLR达到1.67 g/(L∙d)后逐渐下降。金针菇菌包甲烷产率相对稳定，细菌和古菌的多样性指数随OLR递增而增长。稻秆和甘蔗叶同属于碳质量分数高的秸秆类物料，二者的细菌和古菌的菌群结构变化明显；但在OLR达到2.78g/(L∙d)时，稻秆受系统酸化（VFA/TIC>0.8）影响，甲烷产率下降明显，细菌和古菌的多样性指数也出现下降；而甘蔗叶则因VFA/TIC<0.8，其甲烷产率在发酵过程中未出现明显下降。此外，不同C/N物料对优势菌的形成存在影响。其中：为猪粪物料特有的优势古菌；，为金针菇菌包、甘蔗叶特有的优势细菌；为稻秆物料独有的优势古菌。

废弃物；发酵；沼气；C/N；产甲烷特性；菌群结构

0 引 言

近年来，随着现代农业规模化、集约化的快速发展，废弃物产量呈爆发式快速增长趋势。相对发展滞后的资源利用技术和装备，以及废弃物产权属性、政府监管困难等客观原因，导致农业废弃物循环利用方式粗放，甚至直接燃烧或随意堆弃，严重危害到我国农村生态环境、农业生产环境和农民生活环境[1]。

当前，厌氧发酵制备沼气是农业废弃物能源化利用中工程化程度最为高的一种技术，其厌氧微生物作为发酵过程中生命活性的主体[2]，其数量、种类、活性以及与物料之间的传质是影响沼气发酵效率的关键因素。C/N作为发酵物料的一个重要特性，可直接影响微生物的新陈代谢，并通过影响有机物中碳的转化进而影响沼气产量，是近年来相关研究的焦点[3-4]。通常具有较佳产气性能的发酵物料一般都具有适宜沼气发酵的C/N（10～30:1）[5]。例如，猪粪的C/N约为12～14:1，甲烷产率达可到390 mL/g（OLR=1.36 g/(L∙d)）[7]；玉米粉的C/N约为30:1，甲烷产率可达361 mL/g（OLR=1.70 g/(L∙d)）[6]；餐厨垃圾因组成多样，其结果各有差异，但均表现出较高的甲烷产率（537 mL/g，C/N=22:1，OLR=1.46 g/(L∙d)[6]；401 mL/g，C/N=13:1，OLR=2.50 g/(L∙d)）[8]。而当C/N偏高时，因发酵系统面临酸抑制风险以及低氮质量分数对菌群繁殖的影响，物料的产气性能表现不佳。以稻秆（C/N=44:1）、木薯渣（C/N=67:1）、玉米秆（C/N=43:1）为例，其甲烷产率较差，分别仅为134 mL/g（OLR=1.48 g/(L∙d)）[7]、246 mL/g（OLR=1.49 g/(L∙d)）[7]、186 mL/g（OLR=1.64 g/(L∙d)）[7]。当氮质量分数偏高，如以鸡粪（4:1）[8]为发酵物料，其甲烷产率较低，为277 mL/g（OLR=1.62 g/(L∙d)）。相应的菌群结构研究也表现出类似的变化趋势：适宜的C/N有助于发酵微生物的生长繁殖，发酵系统的菌群结构组成也更加丰富；C/N过高、过低均会引起发酵菌群活性的降低。此外，李东等[9]通过鸡粪混合稻草方式调节物料C/N，以此获得更佳的厌氧产气性能。由此可见，无论是单一物料、还是混合物料，C/N均是一个调控厌氧发酵过程的关键参数，不仅影响着厌氧产气性能，而且对微生物的菌群结构、数量及变化规律存在较大影响。但是，上述研究多为固定有机负荷下的连续厌氧发酵；缺乏梯度有机负荷条件下的厌氧产气特性及微生物群落结构的变化规律研究，以及不同C/N物料之间差异性分析。

为此，本研究选择猪粪、金针菇菌包、稻秆和甘蔗叶等4种C/N差异较大的废弃物作为发酵物料，分别进行单一物料的连续厌氧发酵试验，在梯度有机负荷条件下，考察不同C/N物料的日产甲烷量、单位甲烷产率、pH、氨氮（NH4+-N）浓度、挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs）浓度、碳酸氢盐（TIC）碱度和VFA/TIC等指标的变化趋势；分析不同负荷阶段的优势菌群及菌群变化规律。以此，为提高不同类型物料的产气效率及优化多原料混合发酵提供理论依据和试验基础。

1 材料和方法

1.1 发酵原料与接种物

甘蔗叶取自广东省湛江市甘蔗园，阴干后粉碎至1 mm备用；金针菇菌包取自江西省农业科学院农业应用微生物研究所金针菇示范基地，阴干后粉碎至1 mm备用；水稻秸秆取自江西省农业科学院水稻研究所试验田，阴干后粉碎至1 mm备用；新鲜猪粪取自江西省农业科学院畜牧兽医研究所猪场，经简单手工剔除动物毛发和大块石子等杂物后置于4 ℃冰柜内备用；4种发酵物料的基本特性如表1所示；接种物取自江西省新余市罗坊镇沼气站正常运行的沼气工程发酵罐（以猪粪为原料），基本特性如表2所示。

表1 发酵物料的基本特性

注：实验数据以平均值±标准差表示，下同。

Note: Experimental data are expressed as Mean±SD, same as below.

表2 接种物的基本特性Table 2 Basic characteristics of inoculum

注：TIC代表碳酸氢盐碱度，VFA代表的挥发性脂肪酸浓度。

Note: TIC is bicarbonate alkalinity; VFA is volatile fatty acid.

1.2 接种物的活化

接种物的活化方法[10]：首先将厌氧污泥调总固形物质量分数（TS）为6%，加入质量分数1%的活性炭，然后以猪粪为原料在厌氧反应器中进行厌氧发酵（OLR=0.5 g/(L∙d)，以挥发性固体计），待产气稳定后（日产气量无显著性差异）的罐内发酵物即为本实验所需的接种物。

1.3 试验装置与设计

试验装置采用自行改装的厌氧发酵反应器，该装置分A（发酵单元）、B（酸性气体吸附）和C（甲烷体积测量）3个单元。其中A单元是购自瑞典碧普（Sweden Bioprocess）的2 L装厌氧发酵罐（有效容积1.8 L），每个发酵瓶配有可调转速的机械搅拌系统；B单元配有3 mol/L氢氧化钠溶液以吸附沼气中的酸性气体（CO2和H2S等，溴百里酚酞指示剂显示吸收容量上限）；C单元采用排水法收集甲烷并测量其体积（图1）。

注：A为发酵单元（1-1：进料斗，1-2：搅拌轴，1-3：出料阀，1-4：出气阀，1-5：水浴锅）；B为CO2吸收单元；C为测气单元（3-1：集气瓶，3-2：集水瓶）

分别向4个厌氧发酵反应器中，按VS接种物﹕VS物料= 2:1的比例加入接种物和物料（总质量为1.8 kg，TS质量分数约6%）；按图1所示组装厌氧发酵反应器装置，关闭出料阀（1-3），打开出气阀（1-4），通过进料口（1-1）向反应器中鼓吹氮气30～45 s，以排空反应器内部空气，确保发酵的厌氧环境；然后将发酵单元（A）置于水浴锅（1-5）内；待37 ℃厌氧发酵至日产甲烷量低于100 mL/d后，开始进入连续厌氧发酵阶段，即分别投加4种发酵物料（甘蔗叶、金针菇菌包、稻秆和猪粪），进行中温（37±1 ℃）连续厌氧发酵。设计OLR分别为1.11、1.67、2.22和2.78 g/(L∙d)，以可挥发性固体计；水力停留时间为30 d，日进料总量为60 g（各物料添加量详见表3，由蒸馏水补足至60 g）。每天进料6 h后按每隔3 h搅拌10 min的频率进行定时搅拌；每天上午9:00记录甲烷体积；每隔3d对发酵出料检测pH、碳酸氢盐（TIC）碱度、氨氮（NH4+-N）浓度和挥发性脂肪酸（VFAs）浓度。

表3 发酵物料的添加量

1.4 分析方法

总固形物（TS）浓度和挥发性固体（VS）浓度采用称质量法测定[11]。甲烷产量采用沼气通过氢氧化钠溶液后采用排水法测定。发酵液pH值在取样后立即采用上海雷磁PHS-3C型酸度计测定。发酵液的挥发酸（VFAs）浓度和碳酸氢盐（TIC）碱度采用Nordmann联合滴定法[12]测定，样品在4 ℃条件下6 000 r/min离心10 min，取上清液进行指标测定。氨氮（NH4+-N）浓度采用纳氏试剂分光光度法[13]，并通过公式（1）折算游离氨浓度，其中pH指pH值。发酵物料的产甲烷潜力（biochemical methane potential，BMP，即发酵物料的每克可挥发性固体组分所产生的甲烷标准体积）采用瑞典BioProcess公司研发的全自动产甲烷潜力分析测试系统（AMPTS II）进行测定[14]。

1.5 群落结构分析方法

1.5.1 基因组总DNA的提取

为保证条件的均一稳定，在发酵物料的4个OLR中取甲烷产率稳定期的出料为样品，即从当日的出料中取6-8mL发酵液存于10 mL的离心管中，−80 ℃保存，实验结束后统一进行基因组DNA提取。其中，对照组的取样时间为各物料进入连续厌氧发酵阶段的前1 d。采用蛋白酶K法进行基因组DNA提取，具体方法参见文献[15]。

1.5.2 PCR扩增

扩增对象为细菌16s rDNA的V3可变区；引物为518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）和341F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）；对于古菌，引物为518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）和109F（5′-ACGGCTCAGTAACACGT-3′）；为提高变性梯度凝胶电泳（DGGE）分辨率，在518R的5′端加GC夹子（-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGGG-）[16-18]。

反应体系：天根Mastermix 12.5L，引物各1L，模板2L，加无菌水至25L。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

反应条件：对于细菌，94 ℃预变性4 min，然后94 ℃变性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃保温7 min，30个循环；对于古菌，94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火37 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃保温10 min，35个循环。

1.5.3 变性梯度凝胶电泳

在INGENY phorU- 2Dcode Universal Mutation system上进行DGGE分析，聚丙烯酰胺凝胶质量分数为8%，细菌和古菌的变性剂浓度范围分别是35%～65%和35%～50%，在1×TAE缓冲液（称量三羟甲基氨基甲烷 242 g和乙二胺四乙酸 18.612 g于1 L烧杯中，用800 mL去离子水溶解；加入57.1 mL的冰乙酸；用NaOH调pH值至8.3，加去离子水定容至1 L后，室温保存）中，以220 V电压，60 ℃预电泳10 min，然后以140 V电压，60 ℃恒温电泳8 h。电泳结束后，进行硝酸银染色[19]并拍照。用Quantity One软件对DGGE图谱进行分析。

1.5.4 DGGE条带回收及序列分析

选择DGGE图谱中清晰的优势条带，切胶并溶于30L灭菌水中，4 ℃过夜，然后取1L做模板进行PCR反应，引物不带GC“夹子”外，反应条件同上。将重新扩增的DNA片段切胶回收和纯化后，连接到pMD18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行16sRNA测序，登陆NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，将测序结果与数据库中的已知序列进行比对分析。Shannon-Wiener指数（）采用公式（2）计算。

式中为丰富度，为第条带的灰度值与该泳道所有条带灰度值总和的比值。

2 结果分析

2.1 4种物料产甲烷潜力

试验结果表明：4种物料（猪粪、金针菇菌包、稻秆、甘蔗叶）的产甲烷潜力分别为387.4±8.6、210.2±12.0、269.0±8.8和152.4±16.7 mL/g（以挥发性固体计），按大小排序依次分别为：猪粪>稻秆>金针菇菌包>甘蔗叶。其中：猪粪因氮质量分数高，在产甲烷潜力测试中表现最好。稻秆和甘蔗叶的纤维结构致密复杂，且纤维素和半纤维素等可甲烷化的物质组成被木质素包裹，很难被酶水解成可发酵性糖，加之较高的C/N，导致它们的产甲烷潜力远低于猪粪物料。金针菇菌包为食用菌栽培后的废弃物（以木屑、棉籽壳、麦麸等为主），虽然拥有适宜厌氧发酵的C/N（23.7:1），但子实体在生长过程中消耗了大量的纤维素和半纤维素，致使其产甲烷潜力低于C/N（66:1）更高的稻秆。这表明：除C/N外，物料的产甲烷潜力还受物料组成、物理结构等因素影响。

2.2 单一物料的连续厌氧发酵特性

2.2.1 4种不同C/N物料的产甲烷特性变化

日产甲烷量是连续厌氧发酵过程中一个重要监测指标，能够直观反映发酵物料的产气性能。如图2a可知，在连续厌氧发酵反应器中，4种物料的日产甲烷量均随OLR的递增而增加；按大小排序依次为猪粪＞稻秆＞金针菇菌包＞甘蔗叶。其中：猪粪的厌氧产气表现最好，对OLR增加响应迅速；其余3种物料的日产甲烷量随OLR的增加而响应滞后、且增速较缓。

甲烷产率通常用于分析物料在某一发酵条件下的产甲烷能力，其产甲烷潜力转化率（简称BMP转化率）可反映在当前发酵条件下对产甲烷潜力的释放程度。如图2b所示，4种物料的甲烷产率按大小排序依次为猪粪＞稻秆＞金针菇菌包＞甘蔗叶。通过SPASS软件对4种物料在不同OLR阶段的甲烷产率进行差异性分析可知（见表4），随OLR递增，不同C/N物料的产甲烷特性变化趋势各有差异；其中：猪粪的甲烷产率在第2～4个OLR中表现出较为明显的下降趋势，BMP转化率由94.48%降至85.83%；稻秆在前3个OLR的甲烷产率无显著性变化，但在第4个OLR时，甲烷产率下降明显，BMP转化率也由79.78%降至65.24%；而金针菇菌包与甘蔗叶在整个发酵期间，甲烷产率的变化无显著性差异，但BMP转化率不高，均未超过70%。

a. 日产甲烷量的变化情况a. Change of daily methane production b. 单位甲烷产率的变化情况b. Change of methane yield

表4 不同C/N物料的平均甲烷产率*和BMP转化率**

注：显著性水平为0.05，“*”平均甲烷产率为物料在不同OLR下的甲烷产率的平均值，“**”BMP转化率为物料在不同OLR下的平均单位甲烷产率与其甲烷潜力的比值（以百分比计），表中相同字母表示无显著性差异。

Note: Significant difference value is 0.05, “*” average methane yield is the average of daily methane yield under different OLR, “**” BMP conversion rate is defined as average methane yield of material under different OLR against its methane potential (in percentage terms), the same letter in the table shows no significant difference..

2.2.2 不同C/N物料的pH值、NH4+-N、VFAs和VFA/TIC变化

pH值、NH4+-N、VFAs和VFA/TIC等参数与厌氧微生物的物质代谢和发酵活动密切相关。根据已报道文献提出的稳定参考限值如表5所示。

表5 厌氧发酵参数的稳定性限值[5,20-21]

如图3所示，不同物料之间的发酵特性存在较大差异，其C/N差异直接影响4个参数的变化趋势。除pH值在7.5～8.0间波动外，猪粪发酵液的VFAs和NH4+-N浓度均随OLR递增而增加，其中：VFAs浓度和VFA/TIC均在稳定范围内变化；NH4+-N浓度则在第79 d（第3个OLR）时达到5 235 mg/L，突破了5 000 mg/L的稳定参考限值。经公式（1）折算，此时的游离氨浓度约为308 mg/L，是200 mg/L（Liu等[22]认为低于200 mg/L的游离氨浓度有利于厌氧发酵）的1.54倍，使得第3、4个OLR下的氨抑制作用显著增强，这与其甲烷产率的逐步下降趋势一致；但由于接种物源自以猪粪为主要原料的沼气工程，发酵菌群对高浓度的氨氮具有一定的耐受性[23]，使其在第4个OLR下仍可释放85.83%的产甲烷潜力。金针菇菌包的VFAs浓度和VFA/TIC随OLR递增而增加，pH值和NH4+-N浓度则随OLR递增呈下降趋势，但4个参数均处于稳定范围内，推测这是甲烷产率保持相对稳定的主要原因。稻秆和甘蔗叶的VFAs浓度及VFA/TIC随OLR递增均呈现增加趋势；而pH值则逐渐下降，并且在第4个OLR时均小于6.5的稳定值下限，表明VFA的累积超出了发酵系统的缓冲能力，发酵系统面临酸化风险，这也是稻秆的甲烷产率在VFA/TIC超过0.8后明显下降的主要原因。

图3 不同C/N物料的厌氧发酵特性参数随时间变化

2.3 细菌菌群结构分析

2.3.1 细菌DGGE电泳图谱及特征条带序列分析

DGGE 图谱中条带的数目、强度及迁移位置反映了样品中微生物种群的多样性。理论上图谱中每一个条带代表某个微生物优势菌群，条带数目及强度与微生物的种类及相对含量成正比，通过测序和序列比对,可以得出此优势菌群的种类。

如图4所示，4种物料细菌的菌群结构在连续厌氧发酵过程中的表现各有不同。与对照组相比，猪粪的菌落结构在发酵过程中保持相对稳定，推测其原因是接种物取自以猪粪为原料的沼气工程，菌群结构已经适应了氮素丰富的猪粪物料；仅靠OLR的增加无法引起菌群结构上的明显变化，但会引起主要优势细菌在种类和相对含量上的变化，特别是在氨氮浓度大幅超过稳定限值后（第4个OLR）的变化最为明显，这表明主要优势细菌为应对氨抑制的增强正在作出适应性调整。其余3种物料的菌群结构在发酵过程中变化明显，OLR的增加不仅产生了新的条带，而且主要优势细菌的种类和相对含量也随之变化，其中：金针菇菌包的主要优势细菌在第3个OLR后的变化不大，而甘蔗叶和稻秆的主要优势细菌则在种类和相对含量不断改变以适应物料OLR的增加。

注：编号1~5为金针菇菌包、6~10为甘蔗叶、11~15为猪粪、16~20为稻秆；横坐标中2,7,12,17为1.11 g∙((L∙d)-1)负荷；3,8,13,18为1.67 g∙((L∙d)-1)负荷；4,9,14,19为2.22 g∙((L∙d)-1)负荷；5,10,15,20为2.78 g∙((L∙d)-1)负荷；1,6,11,16为对照组,下同。A~K为条带编号。

从图4中选取11个条带进行割胶克隆，送上海生工测序，测序结果经Blast程序与GenBank数据库中序列进行局部同源性比较，比对结果如表6所示，主要为水解和发酵类细菌。条带A，B，K属拟杆菌属()，专性厌氧，有降解蛋白胨或葡萄糖等产酸的功能[24]，为甲烷转化提供前体。条带C属于梭菌属()，专性厌氧，可以分解淀粉、纤维二糖、葡萄糖为碳源和能量，生产氢、乙酸等，但不能利用纤维素[25]；推测这是在猪粪发酵液中条带亮度较强的主要原因。条带D属脱硫代硫酸盐弧菌属()，严格厌氧，主要发酵终产物为乙酸盐和琥珀酸盐[26]，是甘蔗叶对照组中的优势细菌，但在进入连续发酵后逐渐消失。条带E是拟杆菌门一个新属，首次是从海洋沉积物中的分离获得，兼性厌氧，具有产酸功能[27]；在猪粪发酵液中的条带亮度最高。条带F属于普雷沃菌属()，可降解蛋白产生乙酸，在金针菇菌包、甘蔗叶和稻秆的发酵液中均有发现，这与史伟宏[8]等在果蔬、麦秸等富含纤维物料的发现普雷沃菌属()的结论一致。条带G为解纤维素醋弧菌，属于醋弧菌属()[4]，严格厌氧，降解纤维素类物质产酸，并对发酵液中的酸性环境有较好的耐受和调节能力。条带H和条带I分别属于羧酸利用杆菌属()和密螺旋体属()，这2类菌的作用相似，促进物料中的多糖、单糖等水解和产酸[8]。

表6 DGGE图谱中不同条带的序列比对结果

2.3.2 细菌菌群多样性分析

Shannon-Wiener指数（）是反映了细菌菌群多样性高低的常见方法。如图5所示：稻秆的指数介于2.671～3.396，猪粪的指数介于2.668～3.198，甘蔗叶的指数介于2.147～3.020，金针菇菌包的指数介于1.922～3.394。猪粪的多样性指数较对照组相比均有不同程度的下降，且随OLR递增呈现先增后减的现象；这表明在第1个OLR时，细菌就因游离氨的细胞毒性（氨氮浓度超过3 000 mg/L）出现减少，多样性指数大幅下跌，但由于氮素浓度的增长处于细菌菌群的耐受范围，细菌逐渐适应，其种类逐渐恢复，多样性指数回升；直至第4个OLR时，因氨氮浓度大幅超过稳定限值，细菌菌群重新受到抑制，多样性指数又出现回落。金针菇菌包的多样性指数随着OLR递增而增加，这表明适宜的C/N不仅有助于发酵系统的稳定，也为细菌的增殖提供了良好的生长环境。甘蔗叶和稻秆的多样性指数随着OLR递增而增加，但在第4个OLR后，细菌因酸累积抑制导致指数递减。

图5 细菌的Shannon-Weaver指数

2.4 古菌菌群变化

2.4.1 古菌DGGE图谱及特征条带序列分析

如图6所示：与对照组相比，猪粪物料中的菌群结构无明显变化，只是代表主要优势古菌的条带亮度在逐渐增强；直至第4个OLR时，主要优势古菌的种类和相对含量从出现较大的改变，推测这是古菌菌群在氨氮浓度大幅超过5 000 mg/L后作出的适应性调整。金针菇菌包和甘蔗叶在发酵过程中的菌群结构变化较大，其条带数量与对照组相比明显增多，而且主要优势古菌的种类和相对含量也发生了较大变化，表明古菌菌群正在不断适应物料OLR的递增。稻秆物料的菌群结构与对照组相比变化最大，不仅形成了新的优势古菌，而且对照组中的主要优势古菌在连续发酵过程中逐渐消失。

注：a~n为条带编号

从图6中选取14个条带进行割胶克隆，送上海生工测序，测序结果经Blast程序与GenBank数据库中序列进行局部同源性比较，比对结果如表7所示。1）条带a，b，i，j，l属于甲烷杆菌属（），极端严格厌氧，为氢营养型产甲烷古菌，利用甲酸盐、H2等电子供体还原CO2为CH4[28]。其中：条带a在金针菇菌包、甘蔗叶的发酵期间随OLR的递增逐渐减弱；条带b在金针菇菌包、甘蔗叶和猪粪发酵液中均有发现；条带i，j，l在4种发酵物料的所均有发现。2）条带c属于甲烷热球菌属()，极端严格厌氧，为氢营养型产甲烷菌[28-29]，在金针菇菌包、甘蔗叶和猪粪发酵液中均有发现。3）条带e，f，k分别属于甲烷球菌属()、甲烷短杆菌属()和甲烷囊菌属()，极端严格厌氧，为氢营养型产甲烷古菌[30-31]，其中：条带e在稻秆和甘蔗叶的发酵液中均有发现；条带f在金针菇、甘蔗叶和稻秆的发酵液中均有发现，且在金针菇和甘蔗叶的发酵中表现出随OLR递增逐渐减弱的趋势；条带k尽管在4种物料的发酵液中均有发现，但在甘蔗叶和稻秆中的条带清晰、相对含量较高。JOBLIN等[30]在反刍动物瘤胃内发现上述3个属的大部分古菌，推测这3种古菌比较适宜于纤维类物料的厌氧发酵。4）条带n属于甲烷螺菌属()，极端严格厌氧，为氢营养型产甲烷菌[28,29]，仅在稻秆发酵液中发现。5）条带m属于甲烷鬓菌属()，极端严格厌氧，为乙酸营养型产甲烷古菌，以乙酸为唯一能源，代谢产物为CH4和CO2，乙酸和CO2是其生长的碳源[31]；为金针菇菌包、甘蔗叶和稻秆等富含纤维物料发酵液中所共有；在果蔬废弃物[32]、秸秆[24,33]、青贮饲用甜菜[34]、造纸废水[35]等为原料的厌氧发酵罐及反刍动物瘤胃中均能检测到甲烷鬓菌属()，推测其在富含纤维物料的厌氧消化过程中发挥重要作用。6）条带g属于甲烷叶菌属（），极端严格厌氧，最适pH为6.50～6.80，为甲基营养型产甲烷古菌[28-29]，利用甲基类化合物（如甲醇）、甲胺类化合物（如甲胺、二甲胺、三甲胺）和甲基硫化合物（如甲硫醇、二甲基硫）进行生产CH4，逐渐成为猪粪发酵的主要优势古菌。7）条带d为，是从人体粪便分离出的第3个产甲烷古菌新种，只能在H2/甲醇条件下生产CH4，现被归到产甲烷古菌的第7个目中[36-37]，是猪粪和金针菇菌包发酵液中的优势古菌，而在稻秆和甘蔗叶的发酵过程中逐渐丢失。

表7 DGGE图谱中不同条带的序列比对结果

2.4.2 古细菌菌群多样性分析

如图7所示：金针菇菌包的指数介于2.254～3.139，甘蔗叶的指数介于2.589～3.394，猪粪的指数介于2.400～3.070，稻草秸秆的指数介于1.763～2.860。其中：猪粪的古菌多样性指数，较对照组相比均出现不同程度的下降，且随OLR的递增呈先增后减的趋势，这与细菌的多样性指数的变化趋势类似，表明古菌菌群在连续发酵过程中同样受到了游离氨的抑制。金针菇菌包的多样性指数随着OLR递增而增加。稻秆的多样性指数在发酵过程中表现出随OLR递增而增加，但在第4个OLR时，因系统酸累积影响，其多样性指数出现下降现象。甘蔗叶的多样性指数的呈先增后减再增，表明古菌菌群的种类变化比较剧烈，这说明发酵系统的不稳定直接影响了古菌菌群结构的稳定。

图7 古菌的Shannon-Weaver指数

3 结 论

1）受物料C/N的差异影响，4种物料在发酵特性与微生物菌群结构上表现出不同的变化趋势。猪粪的氮素丰富，日产甲烷量最高，且随OLR递增而响应迅速，细菌和古菌的菌群结构在连续发酵过程中与对照组相比变化不大；但受OLR递增以及氨抑制不断增强的影响，主要优势菌在种类和相对含量上作出适应性改变，细菌和古菌的多样性指数呈现先增后减的变化趋势，甲烷产率在第2个OLR后也逐渐下降，相应的BMP转化率也由94.48%逐渐降至85.32%。金针菇菌包含有适宜厌氧发酵的C/N（约23.7:1），甲烷产率相对稳定，日产甲烷量随OLR递增而稳步增长，但BMP转化率不高，介于62.42～68.27%之间；由于物料组成变化和OLR增加，细菌和古菌的菌群结构与对照组相比变化明显，主要优势菌的种类和相对含量也发生明显改变，细菌和古菌的多样性指数稳步升高。稻秆和甘蔗叶同属于碳质量分数较高（66:1，121:1）的秸秆类物料，它们的日产甲烷量均随OLR递增而增加，细菌和古菌的菌群结构也在发酵过程中发生了明显变化；但稻秆在第4个OLR时受系统酸化（VFA/TIC>0.8）影响，甲烷产率下降明显，BMP转化率仅为65.24%，细菌和古菌的多样性指数也出现下降；而甘蔗叶则因VFA/TIC<0.8，其甲烷产率在发酵过程中未出现明显下降。

2）不同C/N物料对发酵菌群中主要优势菌的形成存在影响。在鉴定的优势细菌中，可降解蛋白产生乙酸，在金针菇菌包、甘蔗叶和稻秆等物料发酵液中发现；可降解纤维素产酸，并对酸性环境有较好的耐受和调节能力，在甘蔗叶和金针菇菌包的发酵液中发生。鉴定的优势古菌包括乙酸营养型、氢营养型以及甲基营养型等3类产甲烷古菌。、、、和在富含纤维物料（金针菇菌包、甘蔗叶和稻秆）的发酵过程中均有发现，其中为稻秆独有的优势古菌；（甲烷叶菌属，甲基营养型）是在猪粪厌氧发酵过程中独有的优势菌。

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Anaerobic digestion characteristics and microbial structure of agricultural wastes under gradient organic loadings

Le Xiyi1, Huang Yunhong1, Ren Yuhan1, Chen Liumeng2※

(1.330022,; 2.,330200,)

In recent years, along with the rapid development of modern large-scale and intensive agriculture in China, the output of agricultural wastes shows a rapid increasing trend. Some objective reasons (the lagged development of resource utilization technology and equipment, the attributes of property rights of agricultural wastes, the difficult government regulatory, and so on) lead to the extensive cyclic utilization and even direct combustion or arbitrary discard of agricultural wastes, which has caused serious harms to the rural ecological environment, agricultural production environment and farmers’ living environment in China. The preparation of biogas through anaerobic fermentation is a high-engineering technology for the energy-oriented use of agricultural wastes, and the quantity, species and activity of anaerobic microorganisms for anaerobic fermentation, as well as the fermented substance are the key factors affecting the efficiency of biogas production. C/N, an important character of the fermented substance, can directly affect the metabolism of microorganisms, and also can affect the methane yield through influencing the transformation of carbon in organic matters. In order to understand the effects of gradient organic loadings on the anaerobic digestion characteristics and microbial community structure of greatly different C/N-containing agricultural wastes, the author investigated the performance of methane production and the changes in microbial community structure of anaerobically-digested swine manure, Flammulina velutipes fungal bag, rice straw, and sugarcane top in continuous stirred tank reactor (CSTR) under gradient organic loading rates (OLRs) [1.11, 1.67, 2.22 and 2.78 g/(L∙d), being counted as volatile solid]. The results showed that the daily methane yield of the above four substrates all increased with the increase in OLR, but their methane productive rate and microbial community structure revealed different variation trends due to different C/N ratios of substrates. Among four substrates, swine manure with C/N of 13:1 had the highest daily methane yield, and its bacterial and archaea community structure was similar to that in the control group; whereas due to the increase in OLR and the enhancement of ammonia inhibition, the diversity index of bacteria and archaea increased firstly and then decreased, and the methane productive rate decreased gradually when the OLR reached 1.67 g/(L∙d). Because Flammulina velutipes fungal bag contained a suitable C/N (about 23.7:1) for anaerobic digestion, it had a relatively stable methane productive rate, and its diversity index of bacteria and archaea increased with the increase in OLR, but its microbial community structure was obviously different from that in the control group. Rice straw and sugarcane top had a higher carbon content, with C/N as 66:1 and 121:1 respectively, and their community structure of bacteria and archaea changed obviously in the anaerobic digestion process. When OLR reached 2.78 g/(L∙d), due to the acid accumulation and VFA/TIC above 0.8, the methane productive rate of rice straw decreased obviously, and its diversity index of bacteria and archaea also reduced. However, the methane productive rate of sugarcane top did not decrease obviously in the course of anaerobic digestion, because its VFA/TIC was less than 0.8. Furthermore, the substrate with different C/N had effects on the formation of specific dominant microbial species, and it was found that: Methanolobus zinderi was the specific dominant archaea species in the digested swine manure; Proteiniphilum acetatigenes and Acetivibrio cellulolyticus were the specific dominant bacterial species in the digested Flammulina velutipes fungal bag and sugarcane top, respectively; Methanospirillum hungatei was the specific dominant archaea species in the digested rice straw.

wastes; fermentation; biogas; C/N; methane production characteristic; mircobial structure

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.17.032

S216.4

A

1002-6819(2017)-17-0239-09

2017-04-05

2017-08-09

国家科技支撑计划项目(2014BAC04B02)；江西省重大项目(20152ACF60023)；江西省协同创新专项（JXXTCX201600304）。

勒系意，江西南昌人，主要从事农村能源方面的研究。南昌 江西师范大学生命科学学院，330022。Email：1542885948@qq.com。

陈柳萌，江西赣州人，主要从事农业废弃物的厌氧发酵技术研究。南昌 江西省农业科学院农业应用微生物研究所，330200。Email：13931409@qq.com