饮酒促进TA2小鼠乳腺癌的发生及机制探讨

徐陌，陈志军，桂照华，陈丹蕾，赵浩东，杨帆，汪思应*

(1. 安徽医科大学病理学与病理生理学教研室，合肥 230032； 2. 重庆市云阳县人民医院，重庆4045000)

研究报告

饮酒促进TA2小鼠乳腺癌的发生及机制探讨

徐陌1，陈志军2，桂照华1，陈丹蕾1，赵浩东1，杨帆1，汪思应1*

(1. 安徽医科大学病理学与病理生理学教研室，合肥 230032； 2. 重庆市云阳县人民医院，重庆4045000)

目的探讨酒精是否促进小鼠乳腺癌的发生及可能的作用机制。方法建立饮酒TA2小鼠模型，用ANALOX AM1酒精分析仪检测TA2小鼠血液的酒精浓度，确保动物模型的建立；观察比较酒精组TA2小鼠(饮用含2%酒精的无菌水)与对照组TA2小鼠(饮用不含酒精的无菌水)的乳腺癌发生率、肿瘤的生长速度以及肿瘤的大小；酶联免疫法(ELASA)检测两组小鼠血清中雌激素水平的差异。结果饮酒组TA2小鼠自发乳腺癌的比例显著增加(P<0.05)，成瘤平均天数明显缩短(P<0.05)，生成肿瘤的重量和体积均有增加但差异无显著性 (P>0.05)。饮酒组TA2小鼠体内的雌激素水平明显升高(P<0.05)。结论酒精促进TA2小鼠乳腺癌的发生，该作用可能通过雌激素水平的增加来实现。

酒精；TA2小鼠；乳腺癌；雌激素

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中排名第一[1]。已确定酒精是促发乳腺癌的重要危险因素，现有的流行病学和实验研究表明酒精与乳腺癌风险之间存在正相关性[2-4]。目前关于酒精促进乳腺癌的研究主要集中在酒精可以促进已有乳腺肿瘤的生长，增强乳腺癌细胞的侵袭和转移能力[5-7]。实验室前期也有相关研究，通过建立模拟人类饮酒状况的饮酒小鼠(C57BL/6)模型，证明了一定浓度的乙醇(饮用水中含2%酒精)可以促进小鼠乳腺肿瘤的生长和转移，且酒精上调乳腺癌组织内单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)的水平可能是酒精影响乳腺癌生长转移的机制之一[8]。然而，目前还没有直接的证据证明酒精可以促进乳腺肿瘤的发生，相关的报道并不多见，具有一定的研究价值和意义。

近交系小鼠津白2(Tientsin Albinao 2, TA2)是天津医科大学筛选培育多年建立的自发性乳腺癌高发模型。它于1969年成功繁殖，并于1984年由国际小鼠遗传标准命名委员会认证。TA2小鼠源于KM种小鼠，在无外部诱导剂或致癌物刺激时具有很高的自发性乳腺癌发生率[9]。TA2经产雌鼠自发乳腺癌的发生率为81%，见瘤鼠龄为330 d；未经产雌鼠乳腺癌发生率为41%，见瘤鼠龄为435 d[10]。TA2自培育以来已作为动物模型成功用于多项乳腺肿瘤相关的研究：因其乳腺癌的生物学行为与人妊娠相关乳腺癌(pregnancy-associated breast cancer，PABC)极为相似，是研究PABC浸润转移机制的良好动物模型[11]；且有研究显示TA2小鼠的乳腺癌细胞呈三阴性，是研究三阴性乳腺癌的理想模型[12]。

前期研究中，实验室已成功掌握建立饮酒小鼠动物模型的方法(SPF级C57BL/6雌性小鼠)[8,13]，本实验采用类似的方法建立饮酒TA2小鼠模型，并利用这一模型研究饮酒是否促进乳腺癌的发生及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物

6～8周龄未经产雌性TA2小鼠32只，体重18～22 g，购自安徽医科大学动物实验中心【SCXK(晥) 2011-002】。饲养于安徽医科大学动物实验中心普通环境内【SYXK(晥) 2011-007】，温度22～25℃，昼夜明暗周期12 h/12 h。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇(Sigma公司)；小鼠雌激素(E)酶联免疫检测试剂盒(北京华迈科生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1 TA2饮酒小鼠模型

TA2小鼠随机分为两组(对照组和模型组各16只)，酒精组(n=16)的小鼠自晚上8:00开始给予含2%酒精的饮用水(2 mL无水乙醇+98 mL灭菌水配制100 mL含2%酒精的饮用水)12 h，次日上午8:00更换为常规饮用水至晚上8:00，如此往复。对照组(n=16)的小鼠仅提供常规灭菌饮用水。每天监测常规水与含酒精的水的消耗，对照组和酒精组之间的液体摄入差异无显著性。在早上8:00用1 mL注射器收集小鼠尾静脉血，用Analox AM1酒精分析仪(Analox Instruments，Lunenburg，MA)测定血液乙醇浓度(BEC)。

1.2.2 动物实验

观察记录两组TA2小鼠自发乳腺肿瘤的时间，待自发肿瘤后小鼠生长至濒死状态时(约1年的时间)，结束实验，颈椎脱臼法处死小鼠，取出自发成瘤的肿瘤组织，称取肿瘤组织的重量，并记录肿瘤组织的体积，体积基于下式计算：V=1/2×a×b2(用刻度盘测量肿瘤的两个垂直尺寸径，a为肿瘤最长径，b为肿瘤最短径)。

1.2.3 TA2小鼠血清雌激素水平检测

实验结束后，小鼠眼球取血，室温静置1～2 h后4℃离心(一般4000 r/min,离心20 min)，得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出(注意切勿吸出细胞成分)，分装后置于-80℃保存或立即检测，采用小鼠雌激素(E)酶联免疫检测试剂盒检测小鼠血清雌激素水平，严格遵循说明书的步骤操作。

1.3统计学处理

2 结果

2.1饮酒对TA2小鼠肿瘤发生率的影响

根据实验方法将具有自发乳腺癌特性的TA2小鼠分为酒精组和对照组，实验结束时，酒精组TA2小鼠10只自发乳腺肿瘤，发生率为62.5%(10/16)，而对照组仅7只小鼠自发乳腺肿瘤，发生率为43.75%(7/16)。酒精组TA2小鼠的自发乳腺肿瘤的发生率明显高于对照组。如图1。

2.2饮酒对TA2小鼠肿瘤自然发生时间的影响

分别记录实验组与对照组各小鼠自发乳腺肿瘤的自然发生时间，对照组TA2小鼠平均见瘤鼠龄335 d，2%酒精组TA2小鼠平均见瘤鼠龄285 d。酒精组TA2小鼠自发乳腺肿瘤的时间较对照组明显缩短(P<0.05)，差异具有显著性。如图2。

注：与对照组比，*P<0.05。图1 饮酒对TA2小鼠肿瘤发生率的影响Note. Compared with the control group, *P<0.05.Fig.1 Effect of ethanol on the incidence of breast cancer in TA2 mice

注：与对照组比，*P<0.05。图2 饮酒对TA2小鼠肿瘤自然发生时间的影响Note. Compared with the control group, *P<0.05.Fig.2 Effect of ethanol on the time of spontaneous mammary tumor formation

2.3饮酒对TA2小鼠自发肿瘤重量的影响

待TA2小鼠自发乳腺肿瘤后生长至濒死状态，处死小鼠，取出小鼠肿瘤组织测量其重量，2%酒精组TA2小鼠肿瘤的平均重量略高于对照组，但差异无显著性(P>0.05)。如图3。

2.4饮酒对TA2小鼠自发肿瘤体积的影响

按照实验方法测量各肿瘤组织的最长径和最短径，并计算肿瘤体积大小，饮用2%酒精的小鼠肿瘤体积略大于对照组，但差异无显著性(P>0.05)。如图4。

2.5饮酒对TA2小鼠血清雌激素水平的影响

为了进一步研究酒精促进TA2小鼠自发乳腺肿瘤的机制，我们通过EILSA 实验检测小鼠血清中雌激素水平，结果显示酒精组TA2小鼠的血清雌激素水平明显高于对照组 (P<0.05)，差异有显著性。如图5。

图3 饮酒对TA2小鼠自发肿瘤重量的影响Fig.3 Effect of ethanol on the tumor weight in the TA2 mice

图4 饮酒对TA2小鼠自发肿瘤体积的影响Fig.4 Effect of ethanol on the tumor size in the TA2 mice

注：与对照组比，*P<0.05。图5 饮酒对TA2小鼠血清雌激素水平的影响Note. Compared with the control group, *P<0.05.Fig.5 Effect of ethanol on the level of estrogen in the TA2 mice

3 讨论

酒精是乳腺癌一个已确定的危险因素，并且以剂量依赖的方式增加乳腺癌风险：Smith-Warner及其同事报道了酒精和乳腺癌之间的线性关系，每天饮用含有10 g酒精的饮品乳腺癌的发病率增加10%，且与饮用酒精量呈正相关(总量小于60 g/d)[2]。Singletary和Gapstur2001年也总结了酒精滥用或过度饮酒(≥3次/天)与女性乳腺肿瘤发病率增加之间的关系[3]。近年来关于饮酒与肿瘤的关系及酒精对肿瘤作用机制的研究不断增加，但主要集中在酒精促进肿瘤进展及相关的分子机制的研究。本实验室也曾在前期研究中模拟人类的饮酒状况建立饮酒小鼠模型，并证明了一定浓度的乙醇(饮用水中含2%酒精)可以促进C57BL/6小鼠乳腺肿瘤的生长和转移，且酒精上调乳腺癌组织内MCP-1的水平可能是酒精影响乳腺癌生长转移的机制之一[8]。但酒精是否可以促进肿瘤的发生还没有确切的定论，相关报道也很少见。且目前的研究大都采用体外细胞培养或将乳腺癌细胞接种至免疫缺陷小鼠体内，难以完全模拟人类饮酒的体内生理状况。本研究我们通过模拟人类的饮酒状况建立TA2饮酒小鼠模型，并利用TA2小鼠的高发自发性乳腺癌的特性来探讨饮酒与乳腺癌发生之间的关系。研究结果显示，当TA2小鼠的日常无菌水中添加2%浓度的酒精后，小鼠自发乳腺癌的比例增加，发生率高达62.5%，并且成瘤平均天数缩短，生成肿瘤的重量和体积也有一定增加但不具有显著性差异。以上结果证明了酒精可以促进乳腺癌的发生。本研究为探讨酒精与乳腺癌发生之间的关系提供了一种可能的实验方法和动物模型，在此基础上可以进一步研究酒精促进乳腺癌发生的可能作用机制。

目前已有证据证明雌激素水平的升高是乳腺癌的一个危险因素，高水平的雌激素可以通过激活雌激素途径刺激细胞增殖从而促进乳腺癌的发展[14]。流行病学研究显示，饮酒的女性具有较高的雌激素水平[15]，因此有观点认为酒精可能通过雌激素途径影响乳腺癌：酒精可能通过增加芳香化酶(一种将雄激素转化为雌激素的酶)来增加体内的雌激素水平；也可能增加了其受体ERα的表达，使得酒精存在下乳腺癌细胞对雌激素更加敏感[4,5,16]。我们在TA2小鼠摄入酒精的同时监测其血液的雌激素水平，饮酒组TA2小鼠体内的雌激素水平明显升高，这可能与更高的肿瘤发生率和肿瘤生长速率相关。

总之，酒精可以促进TA2小鼠乳腺癌的发生，该作用可能通过增加雌激素水平而实现，相关作用机制还需进一步研究和探讨。鉴于越来越多的女性经常性饮用酒精饮料，因此了解酒精如何促进乳腺癌的发生发展，确定酒精影响乳腺癌的机制，可以为女性提供乳腺癌与酒精相关的预防建议及治疗策略，降低其发生风险，为其治疗提供新的思路。

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AlcoholpromotesthetumorigenesisofspontaneousbreastcancerinTA2miceandthepossiblepotentialmechanism

XU Mo1, CHEN Zhi-jun2, GUI Zhao-hua1, CHEN Dan-lei1, ZHAO Hao-dong1, YANG Fan1, WANG Si-ying1*

(1. Department of Pathology and Pathophysiology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China； 2. Yunyang County People’s Hospital, Chongqing 404500)

ObjectiveTo explore whether alcohol promotes the development of breast cancer in TA2 mice and the possible potential mechanism.MethodsThirty-two 6-8-week old nulliparous female TA2 mice were randomly divided into control and ethanol-exposure groups, 16 mice in each group. The mice of the ethanol-exposure group were given 2% ethanol in drinking water, and the mice of control group

regular drinking water. Serum ethanol concentration in the TA2 mice was measured using an ANALOX AM1 alcohol analyzer. The incidence of breast cancer, tumor growth rate and tumor size of the ethanol-exposure and control groups were observed and compared. The estrogen levels of the two groups was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELASA).ResultsCompared with the control group, the tumor formation rate of spontaneous breast cancer in the alcohol-exposure group was significantly increased (62.5% vs. 43.75%,P<0.05), the average number of days of tumor formation was shortened (285 days vs. 335 days,P<0.05), the tumor weight and volume were increased but not significant (P>0.05), and the level of estrogen in the ethanol-exposure mice was significantly higher than that in the control group (P>0.05).ConclusionsAlcohol promotes the tumorigenesis of spontaneous breast cancer in TA2 mice, which may be associated to the increase of estrogen levels.

Ethanol; TA2 mouse; Breast cancer; spontaneous; Estrogen level

WANG Si-ying. E-mail： sywang@ahmu.edu.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0563-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.017

2017-04-03

徐陌，女，研究生，E-mail： xumo820@foxmail.com

汪思应，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤分子生物学。E-mail： sywang@ahmu.edu.cn