角叉菜胶诱导慢性非细菌性前列腺炎动物模型的制备与评价

戴应和，龙小琴，刘晨琪，杨淑贤，李立勇，袁经权，易蔚，曹丽*

(1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所， 北京 100193； 2. 广西中医药大学药学院， 南宁 530001； 3. 广西药用植物园， 南宁 530023； 4. 哈尔滨商业大学，哈尔滨 150076)

研究报告

角叉菜胶诱导慢性非细菌性前列腺炎动物模型的制备与评价

戴应和1,2#，龙小琴2#，刘晨琪4，杨淑贤1，李立勇1，袁经权3，易蔚2，曹丽1*

(1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所， 北京 100193； 2. 广西中医药大学药学院， 南宁 530001； 3. 广西药用植物园， 南宁 530023； 4. 哈尔滨商业大学，哈尔滨 150076)

目的建立化学性慢性非细菌性前列腺炎(chronic non-bacterial prostatitis，CNP)动物模型，为CNP的发病机制及药物研究提供可靠的模型动物及评价方法。方法将SD雄性大鼠随机分为对照组和模型A、B、C组，模型A、B、C组分别用1%的无菌角叉菜胶注射至前列腺左右腹侧叶中各20、50、100 μL；对照组每只注入50 μL灭菌的生理盐水溶液。7 d后处理，分别从解剖学角度、前列腺指数、白细胞检测、病理切片以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)、IκB激酶(IKKα)、磷酸化IKB-α(p-IKB-α)和环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达的影响5个方面进行分析。结果与假手术组比较，模型A、B、C组的前列腺组织柔软程度下降，弹性减弱，与周围组织发生粘连；前列腺指数、白细胞总数均显著增加(P<0.01)，A、B、C组前列腺指数的增加率分别为21.1%、61.7%和72.7%；白细胞总数增加率分别为75.0%、103.6%和114.8%；病理结果显示A组前列腺间质肿胀较少，B、C组组间质明显肿胀，C组前列腺萎缩明显，部分腺体变性坏死；A、B、C组前列腺组织内NF-κB、IKKα、p-IKB-α、TNF-α和COX-2表达水平出现不同程度的增加，NF-κB炎症通道被激活。结论大鼠前列腺左右腹侧叶注射1%的角叉菜胶各20、50、100 μL，均能够诱导不同程度前列腺炎症反应，但20 μL剂量太小，炎症反应较弱，操作误差大；100 μL炎症反应过强，有一定动物死亡；50 μL剂量所造成的前列腺炎动物模型最为成功，并可明显激活NF-κB炎症信号通路。

慢性非细菌性前列腺炎；动物模型；角叉菜胶

前列腺是男性的主要附属性腺之一，而前列腺炎是骨盆区域的疼痛或伴排尿不适症状的一组疾病，主要发生在20～40岁的男性青年人中，发病率在泌尿外科中约占25%～30%，是一种多发性疾病[1]。慢性非细菌性前列腺炎(chronic non-bacterial prostatitis，CNP)占临床前列腺炎发病率的90%以上，其病因和病机在很大程度上还不清楚，但给患者带来极大的痛苦，成为世界性关注的难治疾病之一[2]。为研究CNP的病因和病机，国内外学者研制了各种动物模型，因前列腺炎病因不明，假说众多，各种模型各有其特点。经文献查实，目前采用角叉菜胶诱导的化学性CNP模型居多，多以解剖学、前列腺指数、白细胞计数(WBC)、病理切片等进行评价[3,4]。但因注射角叉菜胶的剂量不同以及评价指标不完善，很难复制出病理过程与人体相似的动物模型。因此，本实验通过摸索角叉菜胶的注射剂量与评价指标，建立具有病理过程及表现与人体相似、稳定、重复性好的CNP动物模型，为研究CNP的发病机制及药物创制提供可靠的动物模型。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物

选用SPF级雄性SD大鼠40只，体重200～250 g，2月龄。购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2012-0001】。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料(由实验动物中心提供)及自由饮水，12 h循环灯光，恒定湿度，室温(23±2)℃。实验大鼠饲养及组织取材均于中国医药科学院药用植物研究所实验动物中心实验设备内进行【SYXK(京)2013-0023】。本实验所有操作均符合北京市实验动物管理条例。

1.1.2 主要仪器与试剂

角叉菜胶(Sigma，美国)，TNF-α(产品编号：sc-4564)、NF-κB(产品编号：sc-8008)、IKKα(产品编号：sc-166231)、p-IKB-α(产品编号：sc-8404)和COX-2(产品编号：sc-376861)抗体(Santa Cruz公司，美国)，PVDF膜(Millipore公司，美国)，BCA蛋白定量试剂盒(产品编号：CW0014S)、辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔抗体(产品编号：CW0157S)和辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠抗体(产品编号：CW0152S)(北京康为世纪生物科技有限公司，中国)其他常规试剂(北京双环化学试剂厂，中国)。MQX200 型酶标仪(Bio-Tek，美国)，Labofuge 400R型离心机(Heraeus公司，德国)，CKX41型荧光倒置显微镜(Olympus公司，日本)，梅特勒-托利多电子天平(梅特勒-托利多公司，中国)等。

1.2方法

1.2.1 模型制备方法

参考Xian Yang等[5]的方法，用1%的无菌角叉菜胶注射前列腺腹叶中，经过刺激诱导建立SD大鼠化学性CNP模型：动物先适应性饲养7 d按照随机分组原则分为阴性对照组和模型A、B、C组，一共4组，每组10只。将0.1 g的角叉菜胶溶入10 mL 生理盐水中，混匀，配制成1%的角叉菜胶生理盐水溶液，用10%水合氯醛溶液腹腔注射(剂量：0.3 mL/100 g)使大鼠麻醉，并用剪刀剪掉其中下腹部的毛。在无菌条件下，再用酒精棉对大鼠腹部皮肤消毒，在下腹正中剪开2 cm左右的切口，逐层打开腹壁，找到膀胱，用器械轻轻挑起膀胱，并在其后方找到前列腺，用无菌微量调节注射器将20、50、100 μL的1%无菌角叉菜胶溶液分别注射到模型A、B、C组的大鼠前列腺左右腹叶上；对照组每只注入50 μL灭菌的生理盐水溶液。将前列腺放回体内，缝合肌肉、皮肤，消毒伤口，将大鼠回笼中饲养。在伤口处涂抹适量抗生素以防止伤口感染化脓，并每天观察大鼠活动状态、进食量。

注：A：麻醉后常规手术备皮；B：切开腹壁，暴露前列腺；C：向两侧注射角叉菜胶或生理盐水；D：缝合腹壁，用适量抗生素涂抹伤口。图1 1%角叉菜胶溶液注射到前列腺内的手术操作过程Note. A. Routine skin preparation. B. Cut through the abdominal wall, and exposure of the anterior surface of the prostate. C. Bilateral injection of carrageenan solution or saline into the prostate lobes. D. Suture of the surgical incision and local use of antibiotics.Fig.1 The process of surgical operation to inject 1% carrageenan solution into the rat prostate lobes

1.2.2 样本采集

术后7 d，麻醉大鼠，剖开腹腔，充分暴露两侧前列腺腺体。肉眼观察其外观形态；取出称其湿重，取部分前列腺组织，用4%甲醛溶液固定，苏木素-伊红(HE)染色，做病理切片。另部分前列腺组织制备匀浆，Western blot 法测定前列腺组织内TNF-α、NF-κB、p-IKB-α和COX-2表达的变化。

1.2.3 前列腺指数测定

前列腺指数常作为CNP的炎症检测指标，通过记录每只大鼠的前列腺组织的总湿重以及自身体重，即可得到。公式为：前列腺指数=前列腺组织总湿重/大鼠体重(单位：mg/g)。

1.2.4 白细胞检测

用电子天平称取每只大鼠前列腺左侧背叶相同重量的小块前列腺，放入试管内，按4 μL/mg加无菌生理盐水，并充分剪碎，成为混悬液体，用微量移液枪准确吸取20 μL，加入0.38 mL白细胞稀释液的试管中，充分混匀，再滴入细胞计数板上，静置2～3 min，待白细胞下沉；用低倍显微镜计数细胞计数板四角4个大方格内的白细胞总数。公式为：白细胞数/L=4个大方格内的白细胞数/4 × 20 × 107

沉积物是湖泊生态系统的重要组成部分，可以间接地反映水体污染情况（余辉等，2010）。沉积物是营养盐及其他污染物的主要蓄积库，当环境条件发生改变时，沉积物中的有机质会矿化释放出大量氮磷，并消耗水中的溶解氧，对水体造成二次污染（Shen et al.，2013；Wang et al.，2009；徐进等，2014）。因此，研究沉积物中TN、TP和OM的含量及其分布特征对控制水体富营养化和改善生态系统状况具有重要意义（卢少勇等，2012）。

1.2.5 组织病理学检查

取各组用4%甲醛溶液固定的前列腺组织，24 h后梯度脱水、石蜡包埋。制成切片(5 μm)。常规脱蜡脱水后，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。

1.2.6 Western Blot 检测前列腺组织中TNF-α、NF-κB、IKKα、p-IKB-α和COX- 2的表达水平

将前列腺组织制备成匀浆，4℃低温12 000 r /min 离心10 min。对裂解的组织总蛋白上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，将各组的蛋白浓度调到同一水平。制备10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶，每孔加蛋白样品，经电泳后通过半干式电转仪将分离的蛋白转到硝酸纤维素滤膜上。将膜用5%脱脂牛奶含有0.1%吐温20的(TBST)在摇床上封闭2 h，加入一抗后4℃下孵育过夜，将膜用TBST洗3次，每次15 min；加入二抗放在摇床孵育2 h，再次用TBST 洗3次，每次15 min，后加入发光显色剂ECL显色，应用凝胶成像系统扫描分析白条带灰度，对蛋白条带用Photoshop软件进行扫描灰度量化分析，计算各蛋白条带与内参照β-actin的比值。

1.3统计分析

2 结果

2.1解剖学观察

假手术组大鼠前列腺组织柔软，有光泽，富有弹性，与周围其他组织之间几乎没有粘连，在解剖过程中比较容易与其他组织分开。模型A组前列腺组织增大不太明显，柔软程度稍有下降，弹性减弱，与周围组织粘连程度较轻，部分前列腺组织有少量灰白色片状结节。模型B组前列腺组织明显增大，柔软程度下降，失去弹性，与周围组织粘连程度较重，部分前列腺组织表面可见暗红色或灰白色片状结节。模型C组前列腺组织显著增大，部分坏死，柔软程度较低，无弹性，与周围组织粘连十分严重，前列腺组织表面可见暗红色或灰白色片状结节。由解剖学观察结果可见，模型B组炎症程度比较合理。

与假手术组比较，模型A、B、C组中大鼠的前列腺指数均显著增加，具有明显差异(P<0.01)；模型A组前列腺指数的增加率为21.1%，增幅较小；模型B、C组前列腺指数的增加率分别为61.7%和72.7%，增幅比较明显，但模型C组出现动物死亡，说明模型B组是比较合理可行的(见表1)。

表1 前列腺指数(n=10)Tab.1 Prostate indexes of the different groups

注：“─”表示死亡，与假手术组比较：**P<0.01

Note. “─”means rat death.**P<0.01, versus the sham operated control group.

2.3白细胞检测

2.4组织病理学

从病理切片可以看出：假手术组的前列腺被膜正常，可见大小不一的前列腺腺腔，形态不规则，腔内皱壁丰富，充满嗜酸性分泌物；前列腺间质无明显肿胀，较清晰，少量炎症细胞浸润，偶见腔内有粉红染蛋白液，腺体周围有平滑肌纤维、纤维细胞束和毛细血管。模型A组的大部分前列腺组织腺体由柱状上皮细胞变为矮柱状，有的为扁平状，腺体结构改变，充满嗜酸性分泌物；前列腺间质肿胀较少。模型B组的部分腺体由柱状上皮细胞变为矮柱状，腺管间偶见炎细胞浸润，病理改变明显；前列腺被膜增厚，腔内皱壁消失，腺泡破坏。模型C组的腺体由柱状上皮细胞变为矮柱状，腺管间可见炎细胞浸润，前列腺萎缩病理改变严重，说明模型B组的造模程度比较合理(见图2)。

2.5WesternBlot检测前列腺组织中NF-κB、IKKα、p-IKB-α、TNF-α和COX-2表达的影响

在角叉菜胶的诱导下，可产生大量炎症因子，而NF-κB作为经典的炎症相关信号通路在前列腺炎模型中扮演怎样的角色值得关注。因此，本研究应用Western Blot技术分析了NF-κB通路关键蛋白NF-κB、IKKα、p-IKB-α、TNF-α以及COX-2 的表达水平，结果见图3和图4。

从图3和图4的结果看出：与假手术组比较，除模型A组前列腺组织内p-IKB-α、TNF-α和COX-2表达水平不明显(P>0.05)，差异无显著性；模型B组与C组中前列腺组织内NF-κB、IKKα、p-IKB-α、TNF-α和COX-2表达水平显著增加(P<0.01)，差异有显著性；模型A组前列腺组织内NF-κB和IKKα也有不同程度的增加(P<0.05)。说明角叉菜胶诱导的大鼠前列腺炎激活了NF-κB信号通路。

注：A. 假手术组，箭头示前列腺腺体正常，间质无明显肿胀。B. 模型A组，箭头示前列腺间质轻度肿胀。C. 模型B组，箭头示前列腺萎缩，纤维组织增生，间质明显肿胀；有大量淋巴细胞、单核细胞浸润及浆细胞分布。D.模型C组，箭头示腺管间炎细胞浸润，前列腺萎缩，部分腺体变性坏死。(HE 染色，×200)。图2 大鼠前列腺组织病理观察Note. A.A rat of the sham operated group. The arrow indicates normal glandular structure, with no interstitial edema. B. A rat of the model group A. The arrows indicate mild interstitial edema. C. A rat of the model group B. Arrows indicate glandular atrophy, fibrous hyperplasia and interstitial lymphocyte infiltration. D. A rat of the model group C. Arrows indicate glandular atrophy and partial glandular necrosis, and interstitial lymphocyte infiltration. HE staining. ×200Fig.2 Histology of prostate tissues of the rats

注： 假手术组； 模型A组； 模型B组； 模型C组。(下图同)图3 大鼠前列腺组织NF-κB、IKKα以及p-IKB-α的表达水平Note.sham group Model group A Model group B Model group C (The same in the following Fig).Fig.3 Expression of NF-κB, IKKα and p-IKB-α in the prostate tissues of the rats

图4 大鼠前列腺组织TNF-α和COX- 2 的表达水平Fig.4 Expression of TNF-α and COX- 2 in the prostate tissues of the rats

3 讨论

CNP动物模型是探索其发病机制及治疗方法的基础，而CNP动物模型有着不同的造模方法。目前，最常用的CNP动物造模方法分为免疫性CNP动物造模法和化学制剂直接注射法两大类[6]。免疫性CNP动物造模是根据CNP的发病可能与机体免疫反应失调有关，但还处于探索阶段，尚不成熟[7]。化学制剂直接注射法理论基础成熟，易于操作，且病理过程与人体相似,是CNP模型的主要造模方法。角叉菜胶是一种诱导非特异性炎症模型的经典试剂，也是诱导CNP动物模型最常用的化学试剂[8]。目前注射角叉菜胶的剂量多为20 μL和100 μL，均存在不同程度的问题，不能完全满足评价CNP动物模型药物的要求，譬如Chen[9]和Chen[10]在SD大鼠中注入20 μL 1%角叉菜胶诱导CNP动物模型，由于注的量比较少，模型不太稳定；兰量园等[11]在雄性Wistar大鼠前列腺左右两侧腹叶分别注入1%角叉菜胶生理盐水溶液100 μL诱导CNP动物模型，由于注的量较多，容易造成部分液体漏出，不同动物的炎症程度会受到影响。目前注射50 μL 1%的无菌角叉菜胶诱导CNP动物模型的报道较少。因此，笔者首次对注射20、50和100 μL三个剂量进行对比研究，并通过解剖学、前列腺指数、白细胞计数、病理切片以及TNF-α、NF-κB、IKKα、p-IKB-α和COX-2的表达水平进行指标评价，寻求制备可重复、稳定、炎症反应程度尽量一致的大鼠化学性CNP动物模型。

角叉菜胶诱导前列腺炎时，前列腺会出现增大，前列腺组织和周围组织发生粘连，出现暗红色或灰白色片状结节[9]；可以从前列腺脏器指数和解剖学角度直观地分析模型的成功性。WBC是反应炎症程度的标志性指标，在临床诊疗中，前列腺是否存在炎症、炎症的严重程度以及治疗的效果均可以依据前列腺液中WBC计数进行判断[12]；故白细胞计数可以评价动物模型是否成功。NF-κB 是一种多功能核转录因子，在炎症反应过程中起到重要的调节作用，激活后可以促进细胞因子、黏附因子、趋化因子、COX-2及一氧化氮合酶等表达及基因转录[13]。NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物IkB激酶(IKK)，在TNF-α等因子的刺激下，IKK被激活，使IκB被磷酸化，IκB从NF-κB上脱落并被泛素化，NF-κB由抑制状态被激活，使IKB-α磷酸化形成p-IKB-α，在COX-2的参与下产生前列腺素，引起疼痛[14]。在有慢性非细菌性前列腺炎(CNBP)时,TNF-α显著升高, TNF-α等免疫反应产物或免疫复合物通过刺激神经末梢可引发前列腺炎,产生更加复杂症状[15]。

本研究结果显示，经角叉菜胶诱导后，与假手术组比较，模型A、B、C组的前列腺组织和周围组织均发生不同程度的粘连，模型A组织粘连程度较轻，模型B、C组与周围组织粘连程度较重，可见暗红色或灰白色片状结节，模型C组前列腺组织出现不可逆坏死，而且有动物死亡。模型A、B、C组的前列腺出现了不同程度的增大，无论是前列腺指数还是白细胞总数，模型A组增加较小，模型B、C组增加显著。模型A组NF-κB抗炎通路关键蛋白表达水平有小幅增加，模型B、C组增加显著。由此可知，模型A组炎症程度较轻，不太稳定；模型C组炎症程度较重，甚至造成一些不可逆的损失。其主要原因可能是模型A组注的量较少，不好把控，导致模型不稳定；模型C组注的量较多，加上前列腺本身较小，瞬间膨胀，超出了前列腺的承受范围，造成一些不可逆的损伤，甚至动物死亡，故很难得到可行的CNP动物模型，难以准确的评价药效。模型B组注的量适中，模型稳定，能够得到可行的CNP动物模型。

综上所述，SPF级的雄性SD大鼠(体重220-250 g)，2月龄，用1%的无菌角叉菜胶注射至前列腺左右腹侧叶中各50 μL，可制备稳定、个体反应较为一致的大鼠化学性CNP动物模型，其病理过程与表现与人体相似。本研究对角叉菜胶诱导CNP模型方法的合理改进以及评价方法的建立，为CNP的病因病机研究以及对抗CNP的药物研发提供了良好的工作基础。

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Preparationandevaluationoftheratmodelofchronicnonbacterialprostatitisinducedbycarrageenan

DAI Ying-he1,2#, LONG Xiao-qin2, LIU Chen-qi4, YANG Shu-xian1, LI Li-yong1, YUAN Jing-quan3, YI Wei2, CAO Li1*

(1. Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193； 2. College of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001； 3. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning 530023； 4. Research Center of Life and Environment Science, Harbin University of Commerce, Harbin 150076)

ObjectiveTo establish an animal model of chronic nonbacterial prostatitis induced by chemical substances, and provide a reliable animal model and evaluation method for pathological mechanism and pharmaceutical research of chronic nonbacterial prostatitis.MethodsSD male rats were randomly divided into control group and model groups A, B and C. The three model groups were respectively treated with 20, 50 and 100 μL of 1% sterile carrageenan, injected into the left and right ventral lobes of rat prostate. The control group was injected 50 μL sterile normal saline. The rats were sacrificed at 7 days after carrageenan injection, and the anatomical changes were analyzed, and the prostate index, leukocyte count, the histology of prostate, and the protein expressions of TNF-α, NF-κB, IKKα, p-IKB-α and COX-2 were analyzed.ResultsCompared with the sham operation group, the softness of prostate tissue of groups A, B and C was decreased, the elasticity of the prostatic tissue was weakened, and the prostate tissues of model groups were adhered to surrounding tissues. The total number of leukocytes and the prostate index of model groups A, B and C were significantly increased (P<0.01), by 21.1%, 61.7% and 72.7%, respectively. The total increase rate of white blood cell in the model groups A, B and C was 75%, 103.6% and 114.8%, respectively. Pathological examination showed that the interstitial edema of the prostate of model group A was minimal, but obvious in the groups B and C. Moreover, in the group C, the prostate atrophy was obvious, and some of the glands were degenerated and necrotic. The protein expression levels of NF-κB, IKKα, p-IKB-α, TNF-α, and COX-2 in the prostate tissue were increased to a different extent in all model groups.ConclusionsInflammatory reactions can be induced by injecting 20, 50 or 100 μL of 1% sterile carrageenan into the right and left ventral lobes of the rat prostate. However, the 20 μL dose is too small, inducing only weak inflammatory response, with considerable operation error, while the dose of 100 μL induced excessive inflammatory response, even rat death. The dose of of 50 μL injection is most suitable to establish rat models of nonbacterial prostatitis, showing apparent activation of NF-κB inflammatory signaling pathway.

Chronic nonbacterial prostatitis; Animal models; Carrageenan

CAO li. E-mail： lcao@implad.ac.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0544-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.014

2017-03-29

戴应和(1989-)，苗族，在读硕士，中药学(中药药理方向)。E-mail： daiyinghegz@126.com;龙小琴(1991-)，女，硕士研究生，专业：在读硕士，中药学(中药药理方向)。E-mail： longxiaoqin128@126.com

#共同第一作者

曹丽，女，博士，研究员，硕士生导师，研究方向：肿瘤药理学。E-mail: lcao@implad.ac.cn