溶栓颗粒对急性脑梗死大鼠海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响

2017-11-01汤光花陈永新张瑞岭

中国中医急症 2017年10期

关键词：丁苯海马外周血

桂瑶汤光花陈永新张瑞岭

（1.湖北省武汉市红十字会医院，湖北武汉430000；2.新乡医学院第二附属医院，河南新乡453002）

溶栓颗粒对急性脑梗死大鼠海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响

桂瑶1汤光花2陈永新2张瑞岭2

（1.湖北省武汉市红十字会医院，湖北武汉430000；2.新乡医学院第二附属医院，河南新乡453002）

目的观察溶栓颗粒对急性脑梗死大鼠海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组，每组10只，采用改良线栓法制作急性脑梗死大鼠模型。21 d后评价行为学改变，观察大鼠海马区神经元凋亡情况，免疫组化法检测脑组织Caspase-3蛋白表达，ELISA法测定外周血肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-8（IL-8）水平。结果21 d后模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组行为学指标明显低于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组明显高于对照组（P＜0.05）。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白表达明显高于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于对照组（P＜0.05）。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明显高于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于对照组（P＜0.05）。结论溶栓颗粒可改善急性脑梗死大鼠模型的行为学指标，修复神经元细胞损伤，降低脑组织Caspase-3蛋白和外周血中细胞因子表达。

溶栓颗粒急性脑梗死神经元Caspase-3细胞因子

急性脑梗死是脑供血障碍造成脑细胞缺血缺氧发生坏死，导致系列神经症状，发病率高、致死率高，可由颅脑损伤、颈内动脉血血栓脱落、手术血栓等引起，严重威胁人体健康。急性脑梗死发病复杂，可能与大脑神经递质减少导致心理和精神活动低下有关，可能与激素异常导致炎症细胞因子升高等有关[1-3]。急性脑梗死治疗多采用抗血小板聚集、神经保护等综合，易引起多种副作用，临床应用受到限制[4]。中医学认为急性脑梗死是由气机郁滞、气虚血瘀导致，病因为情志内伤，病机为忧思郁怒，肝气郁结，治宜理气开郁，调畅气机为主[5]。溶栓颗粒具有升降并举、气血同调、痰瘀并治、标本兼顾，治疗急性脑梗死有较好的临床疗效，但其机制不清[6]。本研究通过建立急性脑梗死模型大鼠，研究溶栓颗粒对急性脑梗死模型大鼠海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响，探讨溶栓颗粒治疗作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠，雄性，体质量（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。在（23±2）℃环境中采用12 h昼夜节律饲养，研究过程中自由饮水进食，白天（9：00～17：00）进行试验研究。

1.2 药物与试剂溶栓颗粒（新乡医学院第二附属医院制剂室）；丁苯酞（美国礼来公司，生产批号L01984）；羧甲基纤维素钠和Caspase-3试剂盒购于英国Abcam公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-8（IL-8）试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司；TUNEL凋亡试剂盒和DAB显色试剂盒购于碧云天生物科技有限公司；PBS缓冲液和二抗购于宝生物工程有限公司；其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水。

1.3 实验仪器LDZ-2型低速离心机（北京京立离心机有限公司）；WGY-10型分光光度计（天津光学仪器有限公司）；Mini-PROTEAN3电泳、ELx800酶标仪及Mini-PROTEAN3电转移系统（美国伯腾仪器有限公司）；电子天平（瑞士梅特勒公司）；超低温冰箱（合肥美菱股份有限公司）；倒置x51显微镜（日本奥林巴斯有限公司）。

1.4 造模与分组自由饮食适应性喂养7 d后，选择敞箱实验评分相近的40只大鼠随机分为对照组、模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组，每组10只。对照组正常饲养。将模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组大鼠，水合氯醛麻醉，俯卧固定于手术台，采用改良线栓法制作急性脑梗死大鼠模型。模型组自由饮水进食，溶栓颗粒组第2日开始灌服溶栓颗粒，剂量200 mg/kg，丁苯酞组第2日开始灌服丁苯酞，剂量0.28mL/kg，溶栓颗粒组和丁苯酞组每日灌胃1次，连续20 d。

1.5 标本采集与检测1）行为学评价。21 d后采用敞箱实验评价各组大鼠的行为学。在80 cm×80 cm×40 cm四壁涂黑的正方形纸板箱底面画25cm正方形，将大鼠放入箱底，安静状态下记录3 min内大鼠在正方形纸板箱的水平次数、直立次数和修饰次数。然后对大鼠进行糖水消耗实验，大鼠给予纯水和1%蔗糖水，记录24 h的消耗量。糖水偏爱度=1%蔗糖水量/总水量×100%。2）神经元检测。行为学测试完毕后，眼球取血处死动物。在4℃迅速取脑，生理盐水清洗后，冰冻切片，选取海马组织切片，PBS洗涤3次，贴片，晾干，二甲苯脱脂，酒精脱水，焦油紫染色，水清洗，盐酸-酒精分色，酒精脱水后中性树胶封片。切片脱蜡脱水，蛋白酶K消化，PBS清洗，滴加TUNEL试剂盒反应液和复合液，DAB显色，苏木素复染并封片。显微镜下随意取5个视野，观察海马神经元形态改变和海马区棕褐色凋亡细胞数。3）Caspase-3蛋白分析。眼球取血处死动物后取脑组织，冻存管分装，液氮保存。解冻后研磨脑组织，加入预冷的蛋白裂解液，4℃条件下10000 r/min离心20 min，取上清，采用蛋白质定量试剂盒测定总蛋白。采用SDS-PAGE电泳分离脑组织总蛋白，电转移至PVDF膜上，PBS液洗10 min。蛋白封闭后，GAPDH为内参，加入Caspase-3一抗和二抗，以1∶1000偶联辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG孵育30 min，暗室曝光、显影、晾干，凝胶图像处理软件分析光密度值。4）细胞因子检测。21 d处死实验动物，采集外周血，3000 r/min离心15min，分离血清后-80℃保存。采用ELISA法测定外周血TNF-α、IL-2和IL-8细胞因子水平，严格按照试剂说明书操作。

1.6 统计学处理应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验比较组内和组间差异，计数资料以n（%）表示，应用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评价结果比较见表1。21 d后模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组行为学指标明显低于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组明显高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。但溶栓颗粒组和丁苯酞组行为学指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白比较见表2，图1。对照组海马神经元细胞排列规则，细胞丰富，神经元胞膜完整，胞核形态正常；模型组海马神经元细胞排列不规则，细胞减少，细胞紊乱变稀，神经元胞膜破裂，细胞脱落形成空泡；溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元细胞排列较规则，细胞较丰富，神经元胞膜较完整，部分细胞萎缩、核变小，有部分空泡。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元凋亡数明显高于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于模型组（P＜0.05）。溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元凋亡数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组脑组织Caspase-3蛋白表达明显高于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于模型组（P＜0.05），但溶栓颗粒组和丁苯酞组脑组织Caspase-3蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠行为学评价结果比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别n 水平得分（分）垂直得分（分）修饰次数（分）糖水偏爱度（%）对照组10模型组10溶栓颗粒组10 14.61±1.23 85.26±7.24 6.39±1.02 81.56±6.23 7.25±0.96*35.17±5.62*1.53±0.96*36.72±5.13*12.34±1.32*△73.41±6.89*△3.72±1.12*△70.15±5.67*△丁苯酞组1012.51±1.38*△74.10±7.05*△4.06±1.22*△71.03±5.18*△

表2 各组大鼠海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白比较（±s）

组别n 神经元凋亡数（个）Caspase-3蛋白光密度值（OD）对照组10模型组10溶栓颗粒组10 12.34±2.67 0.76±0.11 61.27±6.81*2.34±0.15*31.51±5.47*△1.51±0.12*△丁苯酞组1032.64±5.31*△1.48±0.13*△

图1 各组大鼠海马神经元形态结构（DAB-苏木素，400倍）

2.3 各组大鼠外周血中细胞因子水平比较见表3。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明显高于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于模型组（P＜0.05）。但溶栓颗粒组和丁苯酞组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠外周血中细胞因子水平比较（ng/mL，±s）

组别n TNF-αIL-2 IL-8对照组10模型组10溶栓颗粒组10 32.17±4.71 3.42±0.16 1.83±0.11 61.42±6.27*5.73±0.39*4.57±0.27*46.38±5.33*△4.41±0.25*△3.24±0.15*△丁苯酞组1045.26±5.41*△4.26±0.23*△3.13±0.12*△

3 讨论

急性脑梗死发病机制复杂，可能与单胺类神经递质、甲肾上腺素、胆碱能-去甲肾上腺素等有关，大脑神经递质在神经突触间浓度减少，导致心理功能和精神活动低下，海马神经元凋亡是神经退行性病变的主要病理基础[7]。近年来发现外周血TNF-α、IL-2等细胞因子与急性脑梗死密切关系[8]。急性脑梗死属中医郁病范畴。郁病主要由七情所伤、情志不遂，或郁怒伤肝、肝郁气滞而发病，病位在肝。因此，治郁之要，在于气血同调、痰瘀并治[9-10]。溶栓颗粒由枳实、柴胡、川芍、地龙、泽兰、水蛙、丹参组成，具有疏肝解郁、调理气血之功，治疗郁病具有较好的临床疗效，但其作用机制尚不清楚。本研究通过分析其对急性脑梗死大鼠模型的行为学、海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平，探讨溶栓颗粒治疗急性脑梗死的机制，为其临床应用提供依据。

本研究发现，21 d后模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组行为学指标明显低于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组明显高于对照组，说明溶栓颗粒治疗急性脑梗死具有较好的疗效。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白表达明显高于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于对照组。说明溶栓颗粒可修复神经元细胞损伤，降低脑组织Caspase-3蛋白表达，可能是由于溶栓颗粒方中枳实和柴胡为君药，疏肝解郁，调达肝气；川芍、丹参共为臣药，行气活血之功，助君药调理气血；水蛭、地龙、泽兰为佐药，活血破血，熄风通络配主药以利气血的畅通；诸药相配，升降并举、气血同调、痰疲并治、标本兼顾。具有疏肝解郁、调理气血之功效[11-12]。柴胡皂苷通过激活凋亡途径上游蛋白Caspase-9，激活下游凋亡蛋白Caspase-3，产生促进细胞凋亡作用[13]。栀子恢复海马的结构与功能。同时本研究发现，模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明显高于对照组，而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于对照组，说明溶栓颗粒可降低外周血中细胞因子表达。这与柴胡疏肝解郁，抑制海马区细胞形态和活性，减少海马区神经细胞凋亡，丹参活血化瘀，减少外周血TNF-α、IL-2和IL-8的产生有关[14-15]。

综上所述，急性脑梗死模型大鼠的海马神经元损伤严重，产生大量神经元凋亡，脑组织Caspase-3蛋白升高，增加外周血中细胞因子，溶栓颗粒可改善急性脑梗死模型大鼠的行为学指标，修复神经元细胞损伤，降低脑组织Caspase-3蛋白和外周血中细胞因子表达。

[1]闫薪如，冯娟.血清血管生成素1水平与急性脑梗死发病、病情严重程度及90 d预后的关系[J].临床神经病学杂志，2016，29（2）：113-116.

[2]何志聪，范燕明，陈赟，等.急性脑梗死发病后6～12 h应用小剂量尿激酶、低分子肝素和奥扎格雷钠联合治疗的临床效果研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2016，24（9）：43-46.

[3]陈琪，李国强，李惊涛，等.神经节苷脂联合长春西汀治疗方案对急性脑梗死患者康复期神经功能重建的影响[J].海南医学院学报，2016，22（22）：2673-2676.

[4]于翔，罗俊超.中医辨证施护对急性脑梗死患者神经功能缺损和日常生活能力的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2014，12（2）：247-248.

[5]艾宗耀.中医药治疗急性脑梗死的临床研究概况[J].中国中医急症，2014，23（11）：2061-2063.

[6]曹晓岚，任丽，臧运华，等.溶栓颗粒对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2005，3（1）：37-38.

[7]肖正文，王妍.急性脑梗死中医辨证分型与客观指标的临床研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2014，12（3）：363-365.

[8]陈维铭，钱涯邻，李晓波，等.急性脑梗死不同中医证型患者血栓常规的变化及其意义[J].临床神经病学杂志，2014，27（6）：458-460.

[9]符布清，赵春，沈建江，等.急性脑梗死中医证型与TSOD、NO、MDA的相关性分析[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14（20）：2348-2349.

[10]慕海军，雷琦.急性脑梗死患者中医辨证分型与hs-CRP TNF-α 水平的相关性研究[J].中国中医药科技，2016，23（4）：379-380.

[11]臧运华，唐明，郭瑞友，等.含溶栓颗粒血清对TNF-α损伤人脐静脉内皮细胞VEGF的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（2）：192-194.