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溶栓颗粒对急性脑梗死大鼠海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响

2017-11-01汤光花陈永新张瑞岭

中国中医急症 2017年10期
关键词:丁苯海马外周血

桂 瑶 汤光花 陈永新 张瑞岭

(1.湖北省武汉市红十字会医院,湖北 武汉430000;2.新乡医学院第二附属医院,河南 新乡453002)

溶栓颗粒对急性脑梗死大鼠海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响

桂 瑶1汤光花2陈永新2张瑞岭2

(1.湖北省武汉市红十字会医院,湖北 武汉430000;2.新乡医学院第二附属医院,河南 新乡453002)

目的观察溶栓颗粒对急性脑梗死大鼠海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组,每组10只,采用改良线栓法制作急性脑梗死大鼠模型。21 d后评价行为学改变,观察大鼠海马区神经元凋亡情况,免疫组化法检测脑组织Caspase-3蛋白表达,ELISA法测定外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)和白介素-8(IL-8)水平。结果21 d后模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组行为学指标明显低于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组明显高于对照组 (P<0.05)。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白表达明显高于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于对照组(P<0.05)。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明显高于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于对照组(P<0.05)。结论溶栓颗粒可改善急性脑梗死大鼠模型的行为学指标,修复神经元细胞损伤,降低脑组织Caspase-3蛋白和外周血中细胞因子表达。

溶栓颗粒 急性脑梗死 神经元Caspase-3细胞因子

急性脑梗死是脑供血障碍造成脑细胞缺血缺氧发生坏死,导致系列神经症状,发病率高、致死率高,可由颅脑损伤、颈内动脉血血栓脱落、手术血栓等引起,严重威胁人体健康。急性脑梗死发病复杂,可能与大脑神经递质减少导致心理和精神活动低下有关,可能与激素异常导致炎症细胞因子升高等有关[1-3]。急性脑梗死治疗多采用抗血小板聚集、神经保护等综合,易引起多种副作用,临床应用受到限制[4]。中医学认为急性脑梗死是由气机郁滞、气虚血瘀导致,病因为情志内伤,病机为忧思郁怒,肝气郁结,治宜理气开郁,调畅气机为主[5]。溶栓颗粒具有升降并举、气血同调、痰瘀并治、标本兼顾,治疗急性脑梗死有较好的临床疗效,但其机制不清[6]。本研究通过建立急性脑梗死模型大鼠,研究溶栓颗粒对急性脑梗死模型大鼠海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平的影响,探讨溶栓颗粒治疗作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠,雄性,体质量(200±20)g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。在(23±2)℃环境中采用12 h昼夜节律饲养,研究过程中自由饮水进食,白天(9:00~17:00)进行试验研究。

1.2 药物与试剂 溶栓颗粒(新乡医学院第二附属医院制剂室);丁苯酞 (美国礼来公司,生产批号L01984);羧甲基纤维素钠和Caspase-3试剂盒购于英国Abcam公司;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)和白介素-8(IL-8)试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司;TUNEL凋亡试剂盒和DAB显色试剂盒购于碧云天生物科技有限公司;PBS缓冲液和二抗购于宝生物工程有限公司;其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司;实验用水为超纯水。

1.3 实验仪器LDZ-2型低速离心机(北京京立离心机有限公司);WGY-10型分光光度计 (天津光学仪器有限公司);Mini-PROTEAN3电泳、ELx800酶标仪及Mini-PROTEAN3电转移系统 (美国伯腾仪器有限公司);电子天平(瑞士梅特勒公司);超低温冰箱(合肥美菱股份有限公司);倒置x51显微镜(日本奥林巴斯有限公司)。

1.4 造模与分组 自由饮食适应性喂养7 d后,选择敞箱实验评分相近的40只大鼠随机分为对照组、模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组,每组10只。对照组正常饲养。将模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组大鼠,水合氯醛麻醉,俯卧固定于手术台,采用改良线栓法制作急性脑梗死大鼠模型。模型组自由饮水进食,溶栓颗粒组第2日开始灌服溶栓颗粒,剂量200 mg/kg,丁苯酞组第2日开始灌服丁苯酞,剂量0.28mL/kg,溶栓颗粒组和丁苯酞组每日灌胃1次,连续20 d。

1.5 标本采集与检测1)行为学评价。21 d后采用敞箱实验评价各组大鼠的行为学。在80 cm×80 cm×40 cm四壁涂黑的正方形纸板箱底面画25cm正方形,将大鼠放入箱底,安静状态下记录3 min内大鼠在正方形纸板箱的水平次数、直立次数和修饰次数。然后对大鼠进行糖水消耗实验,大鼠给予纯水和1%蔗糖水,记录24 h的消耗量。糖水偏爱度=1%蔗糖水量/总水量×100%。2)神经元检测。行为学测试完毕后,眼球取血处死动物。在4℃迅速取脑,生理盐水清洗后,冰冻切片,选取海马组织切片,PBS洗涤3次,贴片,晾干,二甲苯脱脂,酒精脱水,焦油紫染色,水清洗,盐酸-酒精分色,酒精脱水后中性树胶封片。切片脱蜡脱水,蛋白酶K消化,PBS清洗,滴加TUNEL试剂盒反应液和复合液,DAB显色,苏木素复染并封片。显微镜下随意取5个视野,观察海马神经元形态改变和海马区棕褐色凋亡细胞数。3)Caspase-3蛋白分析。眼球取血处死动物后取脑组织,冻存管分装,液氮保存。解冻后研磨脑组织,加入预冷的蛋白裂解液,4℃条件下10000 r/min离心20 min,取上清,采用蛋白质定量试剂盒测定总蛋白。采用SDS-PAGE电泳分离脑组织总蛋白,电转移至PVDF膜上,PBS液洗10 min。蛋白封闭后,GAPDH为内参,加入Caspase-3一抗和二抗,以1∶1000偶联辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG孵育30 min,暗室曝光、显影、晾干,凝胶图像处理软件分析光密度值。4)细胞因子检测。21 d处死实验动物,采集外周血,3000 r/min离心15min,分离血清后-80℃保存。采用ELISA法测定外周血TNF-α、IL-2和IL-8细胞因子水平,严格按照试剂说明书操作。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以(±s)表示,采用t检验比较组内和组间差异,计数资料以n(%)表示,应用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学评价结果比较 见表1。21 d后模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组行为学指标明显低于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。但溶栓颗粒组和丁苯酞组行为学指标比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组大鼠海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白比较 见表2,图1。对照组海马神经元细胞排列规则,细胞丰富,神经元胞膜完整,胞核形态正常;模型组海马神经元细胞排列不规则,细胞减少,细胞紊乱变稀,神经元胞膜破裂,细胞脱落形成空泡;溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元细胞排列较规则,细胞较丰富,神经元胞膜较完整,部分细胞萎缩、核变小,有部分空泡。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元凋亡数明显高于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于模型组(P<0.05)。溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元凋亡数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组脑组织Caspase-3蛋白表达明显高于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于模型组 (P<0.05),但溶栓颗粒组和丁苯酞组脑组织Caspase-3蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠行为学评价结果比较(±s)

表1 各组大鼠行为学评价结果比较(±s)

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05。下同。

组 别n 水平得分(分)垂直得分(分)修饰次数(分)糖水偏爱度(%)对照组10模型组10溶栓颗粒组10 14.61±1.23 85.26±7.24 6.39±1.02 81.56±6.23 7.25±0.96*35.17±5.62*1.53±0.96*36.72±5.13*12.34±1.32*△73.41±6.89*△3.72±1.12*△70.15±5.67*△丁苯酞组1012.51±1.38*△74.10±7.05*△4.06±1.22*△71.03±5.18*△

表2 各组大鼠海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白比较(±s)

表2 各组大鼠海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白比较(±s)

组 别n 神经元凋亡数(个)Caspase-3蛋白光密度值(OD)对照组10模型组10溶栓颗粒组10 12.34±2.67 0.76±0.11 61.27±6.81*2.34±0.15*31.51±5.47*△1.51±0.12*△丁苯酞组1032.64±5.31*△1.48±0.13*△

图1 各组大鼠海马神经元形态结构(DAB-苏木素,400倍)

2.3 各组大鼠外周血中细胞因子水平比较 见表3。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明显高于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于模型组(P<0.05)。但溶栓颗粒组和丁苯酞组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠外周血中细胞因子水平比较(ng/mL,±s)

表3 各组大鼠外周血中细胞因子水平比较(ng/mL,±s)

组 别n TNF-αIL-2 IL-8对照组10模型组10溶栓颗粒组10 32.17±4.71 3.42±0.16 1.83±0.11 61.42±6.27*5.73±0.39*4.57±0.27*46.38±5.33*△4.41±0.25*△3.24±0.15*△丁苯酞组1045.26±5.41*△4.26±0.23*△3.13±0.12*△

3 讨 论

急性脑梗死发病机制复杂,可能与单胺类神经递质、甲肾上腺素、胆碱能-去甲肾上腺素等有关,大脑神经递质在神经突触间浓度减少,导致心理功能和精神活动低下,海马神经元凋亡是神经退行性病变的主要病理基础[7]。 近年来发现外周血TNF-α、IL-2等细胞因子与急性脑梗死密切关系[8]。急性脑梗死属中医郁病范畴。郁病主要由七情所伤、情志不遂,或郁怒伤肝、肝郁气滞而发病,病位在肝。因此,治郁之要,在于气血同调、痰瘀并治[9-10]。溶栓颗粒由枳实、柴胡、川芍、地龙、泽兰、水蛙、丹参组成,具有疏肝解郁、调理气血之功,治疗郁病具有较好的临床疗效,但其作用机制尚不清楚。本研究通过分析其对急性脑梗死大鼠模型的行为学、海马神经元凋亡、脑组织Caspase-3蛋白及外周血中细胞因子水平,探讨溶栓颗粒治疗急性脑梗死的机制,为其临床应用提供依据。

本研究发现,21 d后模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组行为学指标明显低于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组明显高于对照组,说明溶栓颗粒治疗急性脑梗死具有较好的疗效。模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组海马神经元凋亡数和脑组织Caspase-3蛋白表达明显高于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于对照组。说明溶栓颗粒可修复神经元细胞损伤,降低脑组织Caspase-3蛋白表达,可能是由于溶栓颗粒方中枳实和柴胡为君药,疏肝解郁,调达肝气;川芍、丹参共为臣药,行气活血之功,助君药调理气血;水蛭、地龙、泽兰为佐药,活血破血,熄风通络配主药以利气血的畅通;诸药相配,升降并举、气血同调、痰疲并治、标本兼顾。具有疏肝解郁、调理气血之功效[11-12]。柴胡皂苷通过激活凋亡途径上游蛋白Caspase-9,激活下游凋亡蛋白Caspase-3,产生促进细胞凋亡作用[13]。栀子恢复海马的结构与功能。同时本研究发现,模型组、溶栓颗粒组和丁苯酞组外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明显高于对照组,而溶栓颗粒组和丁苯酞组低于对照组,说明溶栓颗粒可降低外周血中细胞因子表达。这与柴胡疏肝解郁,抑制海马区细胞形态和活性,减少海马区神经细胞凋亡,丹参活血化瘀,减少外周血TNF-α、IL-2和IL-8的产生有关[14-15]。

综上所述,急性脑梗死模型大鼠的海马神经元损伤严重,产生大量神经元凋亡,脑组织Caspase-3蛋白升高,增加外周血中细胞因子,溶栓颗粒可改善急性脑梗死模型大鼠的行为学指标,修复神经元细胞损伤,降低脑组织Caspase-3蛋白和外周血中细胞因子表达。

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R285.5

A

1004-745X(2017)10-1766-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.025

2017-03-05)

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