AKT、LDH及NMHCIIA在乳腺组织中的表达及相关性研究

王若冰,叶思杨,李董董,张扬贺,张丽红,孙千惠,申祥凤,菅永平,王医术*

(1.吉林大学 病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；2.吉林大学临床医学专业)

AKT、LDH及NMHCIIA在乳腺组织中的表达及相关性研究

王若冰1,2,叶思杨1,2,李董董1,张扬贺1,张丽红1,孙千惠1,申祥凤1,菅永平1,王医术1*

(1.吉林大学 病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；2.吉林大学临床医学专业)

目的检测 AKT、乳酸脱氢酶(LDH)及非肌细胞肌球蛋白重链II型A亚型(NMHCIIA)磷酸化(S1943)在乳腺组织中的表达情况，探讨其在乳腺癌发病机制中的作用及相关性。方法采用免疫组化技术检测AKT、LDH及NMHCIIAp-S1943在25例乳腺增生组织、25例乳腺纤维腺瘤组织和35例乳腺浸润性导管癌组织中的表达情况。结果AKT、LDH、NMHCIIAp-S1943在乳腺增生组织、乳腺纤维腺瘤组织和乳腺浸润性导管癌组织中的表达情况均依次增高，即随着乳腺组织恶性程度的增加表达增高；且AKT与LDH在乳腺组织中表达呈正相关(P<0.005)，LDH与NMHCIIA p-S1943在乳腺组织中表达呈正相关(P<0.005)。结论AKT、LDH及NMHCIIA在乳腺组织癌变的发展过程中起着重要的作用，三者之间存在一定关系。

乳腺癌；AKT；LDH；NMHCIIA ；肿瘤微环境；免疫组化

(ChinJLabDiagn,2017,21:1687)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其死亡主要原因是转移和复发[1]。肿瘤之所以能够发生及转移，肿瘤微环境起着关键作用[2]。微环境的产生离不开肿瘤细胞的糖代谢，有报道显示，肿瘤无氧糖酵解中产生乳酸堆积和远距离转移的发生率之间存在着正相关关系。丝氨酸/苏氨酸激酶AKT，可通过对基因表达和酶活性的调节，促进糖酵解和乳酸的生成。非肌细胞肌球蛋白II(NMII)是细胞骨架的重要组成成分。NMII是由重链(NMHC)和轻链(NMLC)组成的，其中NMLC对NMHC起着稳定和调节作用，NMHC通过磷酸化活化调控细胞的运动。而乳酸对肿瘤细胞侵袭和转移的调控是否与NMHCII有关，尚未见报道。本研究通过免疫组织化学方法观察分析不同乳腺组织中AKT、乳酸的关键酶乳酸脱氢酶(LDH)的表达情况，并分析它们与NMHCIIA可能的关系，研究三者在乳腺癌发生、发展中的作用。

1 材料和方法

1.1标本来源

筛选收集吉林大学基础医学院病理学系2010年1月至2016年7月乳腺活检的85例病例作为研究对象，其中乳腺增生25例，乳腺纤维腺瘤25例，乳腺浸润性导管癌35例。

1.2主要试剂

免疫组化SP试剂盒(福州迈新生物技术公司)，复合消化酶(天津灏阳公司)，DAB 显色试剂盒(福州迈新生物技术公司)，兔抗人AKT2多克隆抗体(Abcam公司)，兔抗人LDH单克隆抗体(Abcam 公司)，兔抗人NMHCIIAp-S1943单克隆抗体(Cell Signaling technology,USA)。

1.3实验方法

按免疫组化试剂盒说明书操作。采用 OLYMPUS DPT2 CCD 图像采集照相，然后应用 Image-Pro Plus 6.0 软件对图像进行定量分析并计算平均IOD值。

1.4统计方法

用SPSS 18.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1AKT、LDH及NMHCIIAp-S1943在乳腺组织中的表达情况

通过免疫组织化学染色观察乳腺增生组织、乳腺纤维腺瘤及乳腺浸润性导管癌中AKT、LDH和NMHCIIAp-S1943的表达情况，判定标准：AKT阳性表达为组织细胞胞浆/胞膜出现棕黄色颗粒，LDH阳性表达为组织细胞胞浆出现棕黄色颗粒。结果显示，AKT在乳腺组织中均呈阳性表达，主要表达于增生细胞、瘤细胞，癌细胞的胞浆/胞膜中，在乳腺浸润性导管癌中为强阳性表达，而在乳腺增生组织和乳腺纤维腺瘤中呈强弱不等的表达。LDH在乳腺组织中均呈阳性表达，主要表达于增生细胞、瘤细胞，癌细胞的胞浆中，但在乳腺浸润性导管癌中为强阳性表达，而在乳腺增生组织和乳腺纤维腺瘤中呈强弱不等的表达。NMHCIIAp-S1943主要定位于胞膜、胞浆和(或)胞核中。在乳腺浸润性导管癌中呈强阳性表达，在乳腺纤维腺瘤和乳腺增生组织中呈强弱不等的表达。

2.2AKT、LDH与NMHCIIAp-S1943的关系

在对乳腺增生，乳腺纤维腺瘤，乳腺浸润性导管癌三类标本进行免疫组化染色后，通过Image-Pro Plus 6.0软件定量分析并计算平均IOD值，结果见表1。乳腺组织标本AKT、LDH的免疫组化染色结果平均IOD值，经Pearson相关性分析得出两者的相关系数r=0.958,P<0.005，具有统计学意义。LDH、NMHCIIA的免疫组化染色结果平均IOD值，经Pearson相关性分析得出两者相关系数r=0.927，P<0.005，具有统计学意义。

表1 各组别平均IOD值

3 讨论

AKT又名蛋白激酶B，同其他AGC激酶一样，受到上游的第二信使调节。同时，它还是重要的信号蛋白分子，是PI3K信号传导通路重要的中心环节。AKT是细胞内、外信号传导的重要节点。癌症中磷酸化的AKT多呈持续地高度活化状态，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌和肺癌中均是如此[3,4]。高度活化的AKT可能会通过以下几种方式参与肿瘤的发展过程：抑制细胞的凋亡与自噬，提高基因突变的速率，加速细胞增殖。其中AKT对肿瘤细胞能量代谢的调控起到最主要的作用，尤其是对肿瘤细胞的经典代谢方式即Warburg效应的影响[5,6]。

另外，在正常的快速增殖细胞如处于快速分裂状态的胚胎细胞，也有糖酵解增强的现象[3]，这暗示着肿瘤细胞可能采用类似于胚胎细胞的某些生长策略来实现其快速增殖的目的。

肿瘤微环境不仅为肿瘤生长提供适宜条件，还是肿瘤与微环境相互作用的场所[7,8]。乳酸作为糖酵解的最终产物，也是一种微环境因子。乳酸化是实体肿瘤中普遍存在的现象。LDH的表达与肿瘤的分化增殖、细胞迁移及浸润侵袭也有着密切的关联。有文献表明，肿瘤的酸性微环境与细胞骨架间存在着某些联系[9,10]。非肌细胞肌球蛋白II是细胞骨架的重要组成成分。作为分子马达蛋白家族中的一员，它不仅为细胞的运动提供动力，还参与细胞的各种生理活动，如细胞迁移与粘附、胞质分裂、囊泡分泌等。NMII是一个六聚体的结构，由重链(NMHC)和轻链(NMLC)组成，其中NMLC对NMHC起着稳定和调节作用，NMHC通过磷酸化活化调控细胞的运动。NMHCII可根据重链不同分为NMHCIIA，NMHCIIB和NMHCIIC三种亚型。我们课题组前期工作表明，在乳腺癌组织和乳腺癌MCF-7细胞中，均存在NMHCIIA和NMHCIIB两个亚型，这两种亚型在乳腺癌细胞的迁移、侵袭等起始阶段，均起着重要的调控作用，且NMHCIIA影响NMHCIIB的表达。已有研究表明非肌细胞肌球蛋白重链IIA磷酸化(S1943)可引起乳腺癌的浸润、转移[11]。而乳酸对肿瘤细胞侵袭和转移的调控是否与NMHCIIA有关，尚未见报道。

我们筛选收集吉林大学白求恩医学院病理学系2010年1月至2016年7月乳腺活检的85例病例作为研究对象，在乳腺增生、乳腺纤维腺瘤、乳腺浸润性导管癌三类标本中，对AKT、乳酸关键酶LDH及NMHCIIAp-S1943进行免疫组化染色后，观察统计发现：AKT、 LDH、NMHCIIA p-S1943均定位于增生细胞、瘤细胞，癌细胞的胞浆/胞膜中，且乳腺浸润性导管癌中AKT、LDH、NMHCIIA p-S1943表达量最高，乳腺纤维腺瘤次之，乳腺增生组织表达量最少，且组间比较差异有统计学意义，说明AKT、LDH、NMHCIIAp-S1943可能在乳腺组织癌变的过程中发挥重要作用。

乳腺组织标本AKT、LDH的免疫组化染色结果平均IOD值，经Pearson相关性分析得出两者的相关系数r=0.958，P<0.005，具有统计学意义，乳腺组织中AKT和LDH表达成正相关。LDH、NMHCIIA p-S1943的免疫组化染色结果平均IOD值，经Pearson相关性分析得出两者相关系数r=0.927，P<0.005，具有统计学意义，LDH和NMHCIIAp-S1943表达成正相关。 由此发现，三者间应发挥着一定的协同作用，共同调节乳腺癌的浸润和转移。

[1]郑 莹,吴春晓,张敏璐.乳腺癌在中国的流行状况和疾病特征[J].中国癌症杂志,2013,23(8):561.

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[3]Vander Heiden MG,Cantley LC,Thompson CB.Understanding the Warburg effect:the metabolic requirements of cell proliferation[J].Science,2009,324(5930):1029.

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TheexpressionandcorrelationofAKT,LDHandNMHCIIAinbreasttissue

WANGRuo-bing,YESi-yang,LIDong-dong,etal.

(KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo examine the expression and correlation of AKT, LDH and NMHCIIAp-S1943 in breast tissue.MethodsThe expression of AKT,LDH and NMHCIIAp-S1943 in 25 cases of cyclomastopathy,25 cases of breast fibroadenoma and 35 cases of invasive ductal carcinoma of the breast (IDCB) was detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of AKT in cyclomastopathy,breast fibroadenoma and invasive ductal carcinoma of the breast rises in turn.Namely,as the degree of malignancy increases,the expression of AKT increases.Similar results were obtained by the expression analysis of LDH and NMHCIIAp-S1943.In breast tissue,the expression of AKT is positively correlative with that of LDH(P<0.005).The expression of LDH is also positively correlative with that of NMHCIIAp-S1943(P<0.005).ConclusionAKT,LDH and NMHCIIAp-S1943 respectively play a significant part in cancerous progress of breast tissue,and there is correlation between AKT,LDH and NMHCIIA p-S1943.

breast cancer;AKT;LDH;NMHCIIA;tumor microenvironment;immunohistochemistry

R737.9

A

2016-11-14)

吉林省科技厅国际合作处项目(20160414023GH);吉林省科技厅重点科技攻关项目(20150204066SF)

*通讯作者

1007-4287(2017)10-1687-03