miR-126和miR-199对乳腺癌细胞周期进程的影响

马寅芙，李首庆，米旭光，魏海峰，谭 岩，方艳秋

(吉林省人民医院 医学诊治实验中心， 吉林 长春130021)

miR-126和miR-199对乳腺癌细胞周期进程的影响

马寅芙，李首庆，米旭光，魏海峰，谭 岩，方艳秋*

(吉林省人民医院 医学诊治实验中心， 吉林 长春130021)

目的探讨miR-126和miR-199在乳腺癌细胞中的表达对肿瘤细胞周期的影响。方法以qRT-PCR检测分析在乳腺癌细胞中miR-126和miR-199的表达情况；以miRNA mimics转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231，检测miR-126和miR-199在表达增高的情况下对乳腺癌细胞周期的影响。结果miR-126和miR-199在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达较MCF-7细胞株明显更低；转染miRNA mimics 48h后，乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的miR-126和miR-199的表达显著上调，可促进细胞凋亡，阻滞乳腺癌细胞周期进程。结论提高miR-126和miR-199在乳腺癌细胞中的表达可抑制肿瘤细胞周期进程，发挥抗肿瘤效果。

miR-126；miR-199；乳腺癌；细胞周期

(ChinJLabDiagn,2017,21:1828)

MicroRNA(miRNA)在多种肿瘤的发生发展过程中，起着癌基因或抑癌基因的作用[1,2]。每种肿瘤都有自己的miRNA表达谱，通过对miRNA在肿瘤中的表达谱分析发现，miRNA对肿瘤具有诊断分析意义，miRNA有可能成为一种肿瘤临床应用的新生物标记物。miRNA在肿瘤中的表达程度不同，对肿瘤产生的作用也有差异。本研究旨在研究miR-126和miR-199在乳腺癌细胞中表达升高时对乳腺癌细胞周期产生的影响和作用。

1 材料和方法

1.1细胞株与试剂人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7为本实验室冻存；胎牛血清、LipofectamineTM2000、 Trizol购自美国Life Technologies公司；DMEM培养、RPMI medium 1640基购自美国GIBCO公司； Has-miR-126 mimics、Has-miR-199 mimics及阴性对照Cel-miR-67 mimics购自上海百奥迈科生物技术有限公司；miR-126、miR-199、U6引物购自上海生工公司；SYBR Green Master购自瑞士Roche公司；RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司；碘化丙啶染液购自北京鼎国生物技术有限公司；其他常用试剂均购自北京化工厂。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和脂质体转染 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231用含双抗(100 μg/mL链霉素，100 U/mL青霉素)、10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基进行培养；MCF-7细胞株用含双抗的RPMI medium 1640培养基进行培养。细胞置于37℃，5% CO2，100%饱和湿度的细胞培养箱中培养。用于转染的细胞，在转染前一天细胞密度达到80%左右时，用胰酶消化将细胞接种至6孔细胞培养板中，以密度为2×105个/孔接种细胞。转染当天细胞密度可达70%左右。每孔转染miRNA mimics 5 μl(终浓度为50 nM)，操作步骤参考脂质体LipofectamineTM2000说明书。转染48 h后，收集细胞分两部分，一部分用于提取RNA，另一部分细胞用于进行流式检测。

1.2.2总RNA提取和qRT-PCR检测 用Trizol法提取乳腺癌细胞株总RNA。用紫外分光光度计测量RNA的纯度和浓度。参考逆转录说明书将1 μg RNA逆转录为cDNA，将获得的cDNA 以5倍稀释用于荧光定量PCR检测。使用2×SYBR Green Master应用ABI7500 Real-Time PCR仪测定。miRNA的表达以U6作为内参，结果以2-△△Ct表示mRNA拷贝数比值。hsa-miR-126:颈环引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′，miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′，hsa-miR-199:颈环引物5′-GTCGT ATCCA GTGCA GGGTC CGAGG TATTC GCACT GGATA CGACT AACCA-3′，miR-199a-3p forward primer:5′-GTCAC AGTAG TCTGC ACAT-3′，miRNA Universal primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′。

1.2.3流式细胞术检测细胞周期 收集细胞：用胰酶消化细胞后离心(1 000 g/min离心5分钟)收集细胞，弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞两次，弃上清。固定细胞： 将1 ml预冷的70%乙醇加入细胞沉淀中，吹悬混匀，4℃固定2 h。染色：离心收集固定的细胞，加1 ml预冷的PBS洗涤细胞，1 000 g/min离心5分钟，弃上清；细胞中加入500 μl碘化丙啶(PI)，缓慢并充分混匀细胞，4℃避光孵育30 min，混匀上机。应用流式细胞仪(COULTER Epics XL)检测，应用Wincycle 32软件进行细胞周期分析。

2 结果

2.1miR-126和miR-199在乳腺癌细胞中的表达水平

实验重复三次(n=3)，每次设3个复孔。应用荧光定量 PCR仪检测miR-126及miR-199在乳腺癌细胞中的表达。结果如图1所示，相对于乳腺癌细胞株MCF-7，miR-126和miR-199在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达明显更低。

注：**.P<0.01

2.2转染miRNAmimics对乳腺癌细胞株MDA-MB-231中miR-126和miR-199的表达影响

以脂质体LipofectamineTM2000分别转染miR-126和miR-199 mimics入MDA-MB-231细胞中，终浓度为50 nM，以U6为内参，Cel-mir-67 mimics为阴性对照(negative control,NC)。用2-ΔΔCt法分析real-time PCR实验数据。重复三次实验(n=3)，每次实验3个复孔。实验结果如图2所示，转染miRNA mimics 48 h后，可使低表达miR-126和miR-199的乳腺癌细胞株MDA-MB-231中此2种miRNAs的表达显著上调(**P<0.01)。

注：**.P<0.01

图2乳腺癌细胞株MDA-MB-231中转染miRNAmimics后miR-126(A)和miR-199(B)表达分析

2.3上调MDA-MB-231细胞中miR-126和miR-199的表达对细胞周期的影响

如图3所示，以流式细胞术检测MDA-MB-231细胞分别转染miR-126和miR-199 mimics后(终浓度为50 nM)，可诱导细胞凋亡(*P<0.05，**P<0.01)。相对于NC对照组，miRNA mimics转染组明显细胞周期受到抑制，G1期阻滞延长(*P<0.05)。结果显示提高MDA-MB-231细胞中miR-126及miR-199的表达水平，可明显抑制乳腺癌细胞的细胞周期进展，诱导肿瘤细胞凋亡。

注：*.P<0.05，**.P<0.01

(A)ApoptoticcellsanalyzedaftertransfectionwithmiR-126andmiR-199mimicsofMDA-MB-231cells;CellcycledistributionanalyzedofmiR-126(B)andmiR-199(C)aftermimicstransfectedinMDA-MB-231cells.

3 讨论

人类发现miRNA所起的作用类似于癌基因或抑癌基因的功能[1,2]。miRNA在肿瘤组织中提高表达，它起到癌基因的作用；而miRNA在肿瘤组织中降低表达，它起到抑癌基因的作用。miRNA的表达调控癌基因或抑癌基因影响细胞的增殖和凋亡。在多项研究中证实，miR-126可在胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌等多种肿瘤中表达下调[3-5]，miR-199在卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、甲状腺乳头状癌、骨肉瘤等肿瘤中表达降低[6]，miR-126和miR-199在乳腺癌中表达均降低[7,8]，而提高miR-126和miR-199的表达可以显著抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭转移，降低肿瘤复发率和提高患者生存率[6,11]。

miR-126和miR-199发挥抑癌基因的作用，可能与其抑制靶基因的表达相关[6,9-11]。在之前的研究中我们发现在乳腺癌细胞中上调miR-126可以降低VEGF的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力；上调miR-199表达可以抑制PAK4的表达，从而抑制PAK4/MEK/ERK途径，乳腺癌细胞的生长，迁移和侵袭能力都受到抑制。

本研究中显示，乳腺癌组织中miR-126和miR-199在不同侵袭力的乳腺癌细胞株中的表达显示出差异，即侵袭力强的乳腺癌细胞株MDA-MB-231相对于侵袭力较弱的MCF-7细胞株 miR-126和miR-199表达明显降低。所以，我们选择表达量相对较低的乳腺癌细胞株MDA-MB-231转染miRNA mimics进行研究。在研究miR-126和miR-199抑制乳腺癌的机制中，我们对其在乳腺癌中表达升高引起的肿瘤细胞凋亡和细胞周期情况进行分析，发现上调这两种miRNA的表达，可诱导乳腺癌细胞凋亡，抑制细胞周期进程，使G1期阻滞延长。由此证明miR-126和miR-199促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞周期进程，是其发挥肿瘤抑制作用的重要机制之一。

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EffectsofmiR-126andmiR-199oncellcycleofbreastcancer

MAYin-fu,LIShou-qing,MIXu-guang,etal.

(MedicalExperimentCenter,JilinProvincePeople’sHospital,Changchun130021,China)

ObjectiveInvestigate the effect of miR-126 and miR-199 on the cell cycle in breast cancer cells.MethodsThe expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cells was detected by qRT-PCR assay;the effect of miR-126 and miR-199 expression on the cell cycle of breast cancer cells was detected after miRNA mimics were transfected into breast cancer cell line MDA-MB-231.ResultsThe expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cell line MDA-MB-231 was significantly lower than that of MCF-7 cell line;after transfection of miRNA mimics 48h,the expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cell line MDA-MB-231 was up-regulated,which could promote cell apoptosis and block the cell cycle progression of breast cancer.ConclusionIncreasing the expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cells can inhibit tumor cell cycle progression and exert anti-tumor effect.

miR-126;miR-199;breast cancer;cell cycle

R737.9

A

2016-10-11)

吉林省科技厅青年科研基金项目(20160520165JH)；吉林省科技厅重点实验室专项建设基金(20160622008JC)；吉林省科技厅自然科学基金项目(20150101178JC)

*通讯作者

1007-4287(2017)10-1828-03