高效液相色谱法同时测定防风中4种主要成分含量

杨晓琴，任红燕

（新疆维吾尔自治区喀什地区食品药品检验所，新疆 喀什 844000）

高效液相色谱法同时测定防风中4种主要成分含量

杨晓琴，任红燕

（新疆维吾尔自治区喀什地区食品药品检验所，新疆 喀什 844000）

目的探讨防风药材的质量控制方法。方法改进高效液相色谱（HPLC）法的色谱条件。色谱柱为迪马Dikma钻石二代C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 m），流动相为甲醇 －水，梯度洗脱，流速为 1.0 mL／min，检测波长为 254 nm，柱温为 25℃，进样量为 2～10 L。结果防风药材中防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅰ、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷进样质量浓度线性范围分别为 0.077 ～ 0.698 g／L，0.039 6 ～ 0.356 g／L，0.029 2 ～ 0.263 g／L，0.018 ～0.162 g／L，平均加样回收率分别为 99.23% ，99.62% ，97.26% ，102.20% ，RSD 分别为 1.90% ，1.67% ，1.40% ，1.36% （n ＝5）。结论改进后的 HPLC 法方法简便，精密度、重复性、准确度均良好，可同时测定防风药材中多种成分的含量。

高效液相色谱法；防风；色原酮类成分；含量测定

防风始载于《神农本草经》，属多年生草本植物，主产于我国东北、华北等地区。药用防风为伞形科植物Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk 未抽花茎的干燥根，具有解热、镇痛、镇静、抗炎、抗菌、免疫、抗癫痫等药理作用，临床应用广泛[1]。防风的功效发挥与成分含量相关，目前已鉴定其含有色原酮、香豆素、多糖类及挥发性成分等100多种化学成分，但多为小分子化合物。为确定药效与基础化学成分的关系，需开展基础化学成分的定量分析研究[2]。高效液相色谱（HPLC）法因操作简便、重复性好、灵敏度高等优势，被广泛应用于中药材的化学成分检测中[3]。本研究中拟改进《中国药典》中HPLC法的色谱条件，以同时测定防风药材的4种化学成分，并比较方法改进前后样品含量检测结果。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

iChrom 5100型高效液相色谱仪（流量范围～10.000 mL ／min，流量准确度不超过 ± 0.2% ，大连依利特分析仪器有限公司）；BK－FD10S型冷冻干燥机（山东博科生物产业有限公司）；Ohaus AX223ZH／E型电子分析天平（量程220 g，可读性1 mg，美国奥豪斯仪器有限公司）；Chencent－10LH型超声波清洗器（输出功率180 W，频率40 kHz，容量6 L，上海臣迅仪器科技有限公司）。

1.2 试药

防风药材购自亳州市龙辉药业销售有限公司，产地包括齐齐哈尔、内蒙古、亳州，经中国中医科学院中药研究所谢宗万教授鉴定为伞形科植物 Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk未抽花茎的干燥根；防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷对照品、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅰ、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷对照品，均由本实验室从药材中分离鉴定，纯度＞98%；甲醇（美国费希尔Fisher公司）为色谱纯；娃哈哈纯净水（杭州哇哈哈集团公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：迪马 Dikma钻石二代 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 水，梯度洗脱（见表 1）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；进样量：2 ～ 10 μL。分别量取对照品溶液 3 μL、供试品溶液2 μL，注入液相色谱仪进行测定。在此色谱条件下，各检测组分色谱峰分离良好，理论板数均大于3 000，色谱图见图 1。

表1 流动相梯度洗脱条件

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

对照品溶液：称取防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷对照品、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷对照品、防风色原酮Ⅰ对照品、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅰ、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷质量浓度分别为 0.388，0.396，0.292，0.270 g／L的对照品贮备液。

供试品溶液：称取防风药材适量，精密称定，加适量稀甲醇回流提取，提取液回收溶剂，残留物加水分散，通过大孔吸附树脂柱，树脂柱水洗除杂后，用稀乙醇洗脱；乙醇洗脱液回收溶剂，残留物减压干燥，得防风色原酮部位。称取防风色原酮部位约10 mg，精密称定，置5 mL容量瓶中，加50%乙醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，备用[4]。

2.3 方法学考察

线性关系考察：量取各对照品贮备液适量，置10 mL容量瓶中，加提取溶剂配制成对照品溶液，防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷对照品溶液进样 2，4，6，8，10，12 μL，其他3 种对照品溶液进样 1，3，5，7，9，11 μL，按拟订色谱条件测定，以进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 线性关系考察结果（n＝6）

精密度试验：精密吸取各对照品溶液4 μL，按拟订色谱条件重复进样5次，依法测定。结果防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅰ、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷峰面积值的 RSD分别为0.98% ，1.31% ，2.01% ，2.11% （n ＝ 5），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一防风药材5份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅰ、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷峰面积值的 RSD分别为2.21% ，1.42% ，2.43% ，2.24% （n ＝ 5），表明方法重复性良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，于配置后 0，2，4，6，8，10 h 时分别进样 4 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅰ、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷峰面积值的 RSD 分别为 0.98% ，0.74% ，0.35% ，1.68%（n＝6），均低于 2%，表明供试品溶液在 10 h内稳定性良好。

加样回收试验：称取已知含量的样品0.25 g，精密称定，加入4种对照品适量，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法测定含量，计算回收率。结果见表3。

2.4 样品含量测定

称取来自不同地区的防风药材各 0.5 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按本研究中拟订的方法（新方法）进样测定含量。同时，采用药典法（旧方法）进样测定，并比较新旧方法的测定结果。结果见表4。

表3 加样回收试验结果（n＝5）

3 讨论

分析药物所含成分，有助于判断药物应用过程的治疗机制。现代药理学研究发现，防风药材中含有防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅰ、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷等，在治疗疾病中具有较好的效果[5－7]。其凭借自身止痛止泻、活血化瘀以及祛风解表等功效，被临床广泛地应用[8－9]。随着目前中药临床治疗地位的提升，国内外也掀起了防风中药临床药理的研究，进一步扩大了防风的市场需求量，开发前景相对广阔。为了保证防风药材的市场地位，加强含防风药品成分、品质的检测尤为重要。近年来对防风质量控制的研究方法也逐渐多样化，定性鉴别包括性状、显微鉴别等方式，定量分析方法包括薄层扫描、HPLC法、紫外分光光度法、胶束和高效毛细管电泳法等[10－12]。中药材的质量控制一般采用色谱指纹图谱技术，而对于中药材成分含量的检测，多采用HPLC－DAD法。为测定防风药材中主要成分的含量，本研究中选取了HPLC法。

表4 新旧方法样品含量测定结果比较（%）

防风含有多种化学成分，包括色原酮、有机酸、杂多糖、聚乙炔等，直接采用流动相梯度洗脱进行含量测定，结果容易产生较大差异，且干扰因素较多[13]。对此，本研究中在试验前均进行了系统的预处理。本研究中采用的提取溶剂为甲醇（熔点－97.8℃，沸点 64.5℃），自身干扰性小，且提取效果理想，可保证较高的提取率。而乙醇虽然价格便宜、无毒，多适用于生产操作的应用。一般分析测试少量提取均采用甲醇，因为甲醇的提取率是乙醇不能比拟的。同时为保证最佳检测效果，利用正交提取工艺，明确了最佳提取方案，即超过防风样本量30 倍的提取溶剂（甲醇），提取 2 次，频率 2 h ／次[14－16]。通过样品处理，保证了检测结果的精确性和准确性，为成分测定打下基础。

本研究中选取的分析指标，主要为防风色原酮Ⅰ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅱ葡萄糖苷、防风色原酮Ⅰ、防风色原酮Ⅲ葡萄糖苷4种成分，通过甲醇回流提取、液相色谱分离，在固定检测波长（254 nm）处测定，采用外标法对其含量进行计算，满足了试验的经济性、准确性等要求。由表4可见，新旧方法检测结果基本一致，同时新方法在操作简易性，测定结果综合稳定性、经济性、精准度等方面也有明显提高。

综上所述，采用本研究中改进的HPLC法，可快速测定防风药材的4种主要成分含量，同时该方法精确性、高效率等也有优势，可为防风药材的质量控制提供参考。

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Content Determination of Four Main Components in Saposhnikovia Divaricata by HPLC

Yang Xiaoqin，Ren Hongyan
（Institute of Food and Drug Administration of Kashi in Xinjiang Uygur Autonomous Region，Kashi，Xinjiang，China 844000）

Objective To investigate the method of quality control of Saposhnikovia divaricata.Methods The chromatographic conditionsof HPLC were improved.The chromatographic column was Dikma diamonsil Ⅱ C18column （150 mm × 4.6 mm，5 μm），the mobile phase consisted of methanol － water，gradient elution，the flow rate was 1.0 mL ／min，the detection wavelength was 254 nm，the column temperature was 25 ℃，the sample size was 2 － 10 μL.Results The linear range of prim －O －glucosylcimifugin，4′－O －β －D －glucosyl－ 5 － O － methylvisamminol，cimifugin，sec － o － glucosylhamaudol were 0.077 － 0.698 g ／L，0.039 6 － 0.356 g／L，0.029 2 － 0.263 g／L and 0.018 － 0.162 g ／L，respectively.The average recoveries were 99.23% ，99.62% ，97.26% ，102.20% ，respectively，and RSDs were 1.90% ，1.67% ，1.40% ，1.36% （n ＝ 5）.Conclusion The improved HPLC method is simple and has good precision，repeatability and accuracy，which can simultaneously determine the content of various components in Saposhnikovia divaricata.

HPLC； Saposhnikovia divaricata；chromone ketone；content determination

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)20－0037－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.010

杨晓琴（1982－），女，汉族，甘肃武威人，大学本科，主管药师，研究方向为药品检验分析，（电子信箱）13797510＠qq.com。

2017－06－06；

2017－07－20)