UHPLC法测定柴黄片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量探讨

河南省驻马店市食品药品检验所（463000）赵晓丽

柴黄片主要由两味中草药制备而成，分别为柴胡和黄芩，属于中成药制剂，患者服用后能够发挥解表清热的效果，在风热型感冒症状中具有良好的用途[1]。现代药理学研究证实，柴黄片中有效成分抗炎、抗菌效果明显。现阶段，柴黄片质量控制标准能够对黄芩的成分黄芩苷进行测定，但是无法对柴胡皂苷类成分进行科学控制。这种情况下，会给柴黄片的用药安全带来一定影响[2]。为此，对柴黄片中柴胡皂苷类成分进行准确测定，具有积极意义。本研究主要采用UHPLC法对柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量进行测定，为进一步完善柴黄片质量控制提供科学依据。

1 仪器与测量方法

1.1 测量仪器与试药 采用高效液相色谱仪（型号为Agi1260），配置DAD检测器，将二异丁基-十八烷基键合硅胶色谱柱作为主要填料。电子天平、超声波清洗仪、旋转蒸发器及超纯水机；选取陕西盘龙制药公司提供的柴黄片，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d由特定渠道分离制备，通过UHPLC法测定，纯度＞98%，其他试剂均为分析纯，如甲醇、超纯水等。

1.2 溶液配制 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d（干燥至恒重）、黄芩苷对照品，其中黄岑苷对照品剂量为11.5mg，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分别为12mg。将上述制品放置在容量瓶中（25mL），添加浓度为50%的甲醇溶解剂，并将其稀释到刻度。将柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分别配制为0.50mg/mL、0.48mg/mL的对照品溶液。采用0.45μm微孔滤膜过滤处理，并放置在零下4℃环境中冷藏，以作备用。

1.3 液相色谱条件 ①柴胡皂苷a：采用Hypersil C18色谱柱法（4.6×250m，5μm），以乙腈磷酸水溶液作为流动相（A）-0.01%；磷酸水溶液（B）；梯度洗脱（0～30min，30%A～60%A），科学设定梯度洗脱值，控制流速（1mL/min），检验波长控制在254nm，柱温则为35℃，运行时间35min，进样量10μL。②柴胡皂苷d：用Hypersil C18色谱柱法（4.6×250m，5μm），以乙腈磷酸水溶液作为流动相（A）-0.01%；磷酸水溶液（B）；梯度洗脱（0～30min，30%A～60%A），科学设定梯度洗脱值，控制流速（1mL/min），检验波长控制在210nm，柱温则为30℃，运行时间35min，进样量10μL。③黄岑苷色谱条件：采用Hypersil C18色谱柱法（4.6×250m，5μm），以甲醇作为流动相，0.2%磷酸溶液（45∶55，V/V），科学设定梯度洗脱值，控制流速（1mL/min），检验波长控制在278nm，柱温则为35℃，运行时间35min，进样量10μL。

1.4 样品处理 柴胡皂苷制备：柴胡皂苷a和柴胡皂苷d供试品的制备方法，分别取3批柴黄片，并采用0.45μm微孔滤膜进行过滤及相应处理，所得柴胡皂苷a供试品和柴胡皂苷d供试品。分别取3批1mg柴黄片于5个100mL容量瓶中，采用流动相进行稀释，至刻度后充分混合均匀。严格根据处方要求，制备阴性对照品，此对照品中不含有柴胡。与此同时，按照柴胡皂苷a和柴胡皂苷d供试品，制备不含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的阴性样品。

2 结果

2.1 专属性实验 精密吸取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品溶液，同时取相应的供试品溶液，结合阴性对照品，并将上述制品注入到液相色谱仪中，并对色谱图进行准确记录。

2.2 稳定性实验 取相同供试品溶液，结合相关操作，对稳定性进行检验，制备进样量，对RSD值进行测量。

2.3 重复性实验 在上述特定色谱条件下，对溶液进行连续性进样处理，并对峰面积进行准确测量，并对柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的RSD含量进行测定。

2.4 试验结果 柴黄片中柴胡皂苷a线性范围为0.98～5.67μg（r2=0.9991），柴胡皂苷d线性范围为0.059～0.052μg（r2=0.9997）；柴胡皂苷a的平均加样回收率为98.0%，柴胡皂苷d的平均加样回收率为96.5%；柴胡皂苷a的RSD为2.0%，柴胡皂苷d的RSD为1.8%。上述研究结果证实，测定峰面积RSD值精密度良好，且供试品溶液在10h之内稳定性良好，说明本研究所采用的测量方法可开展重复性操作，见附表。

附表 柴黄片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量

3 讨论

中药制剂在制备过程中，在兼顾中药制备技术的基础上，综合现代制造技术，在临床多种疾病诊治中发挥重要作用。但是，中药制剂成分比较复杂，在质量控制上存在一定难度，对患者用药安全产生较大影响[3]。

建立完善、科学、有效的药物成分测量方法，并制定出相对合理的限度指标，是现阶段中成药制剂的重要方法。但是，根据目前现有的相关技术标准，中成药方制剂成分测量方法不够完善，很多可控性指标在很大程度上也无含量测量。高效液相色谱法在现阶段中药制剂质量控制与评价中具有广泛的用途，其主要原理为利用指纹图谱技术，对药物有效成分的含量或者所占比例进行分析，从而及时知晓药物中主要成分的总体情况，从而为样品质量控制提供有效帮助，保证中成药制剂本身的科学性与合理性，并保持其使用质量的稳定性，减少用药不良反应，提高患者用药治疗效果。

柴黄片中主要含有两味中草药，分别为柴胡和黄芩，因此选择黄芩的主要成分黄芩苷及柴胡的主要成分柴胡皂苷a、d作为主质量控制的关键性指标，对其进行定量检测，能够明确成分含量。但是，由于两种成分的吸收波长存在一定差异，同时在中成药中含量不同。本研究采用UHPLC法，对柴黄片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量进行测定，结果显示：柴黄片中柴胡皂苷a线性范围为0.98～5.67μg（r2=0.9991），柴胡皂苷d线性范围为0.059～0.052μg（r2=0.9997）；柴胡皂苷a的平均加样回收率为98.0%，柴胡皂苷d的平均加样回收率为96.5%，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的RSD分别为2.0%、1.8%。

以上所得数据说明，测定峰面积RSD值精密度良好，且供试品溶液在10h之内稳定性良好，说明本研究所采用的测量方法可开展重复性操作，UHPLC测量法不仅操作简单，同时具有可靠性，所得数据真实可信，且具有良好的重现性。与此同时，通过上述测量方法，能够最大程度保证柴黄片定量控制指标的科学性，并为其选择提供一定参考。本实验结果表明，所建立的方法能够简便、快速、准确的测定柴黄片中柴胡皂苷a、d的含量，可以作为该制剂的一个质量控制标准。

总之，采用UHPLC法对柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量进行测定，操作简便，安全可靠，具有良好的重现性，在柴黄片中成药主要含量测量中发挥比较重要的作用，能够不断完善中成药方剂质量体系的构建。