紫外光谱法快速测定醒脑静注射液一次提取过程中9种成分

黄凯毅+魏丹妮+方金阳+李晞瑗+严斌俊

[摘要] 该研究建立了一种基于紫外光谱的醒脑静注射液一次提取过程分析方法，用于快速测定蒸馏提取液中异佛尔酮、4-亚甲基-异佛尔酮、莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇、吉马酮9种成分含量。在醒脑静注射液一次提取过程中收集郁金-栀子水蒸气蒸馏液样品166份，扫描紫外光谱，并用高效液相色谱测定9种成分含量，使用最小二乘支持向量机和径向基人工神经网络等方法建立紫外光谱与各成分含量之间的多元校正模型。实验结果表明，该研究建立的紫外光谱分析方法能较准确地测定蒸馏提取液中9种成分含量，预测误差均方根分别为0.068， 0.147， 0.215， 0.319， 1.01， 1.27， 0.764， 0.147， 0.610 mg·L-1。该方法具有快速、简便、低成本的优点，有助于醒脑静注射液提取过程监测和提取终点判断，减少产品质量缺陷和质量差异。

[关键词] 醒脑静注射液； 紫外光谱； 过程分析； 郁金； 栀子； 水蒸气蒸馏； 支持向量机； 人工神经网络

[Abstract] In this study， an analytical method based on ultraviolet spectroscopy was established for the rapid determination of nine components including isophorone， 4-methylene-isophorone， curcumenone， curcumenol， curdione， curzerenone， furanodienone， curcumol and germacrone in the first extraction process of Xingnaojing injection. 166 distillate samples of Gardeniae Fructus and Radix Curcumae were collected in the first extraction process of Xingnaojing injection. The ultraviolet spectra of these samples were collected， and the contents of the nine components in these samples were determined by high performance liquid chromatography. Least squares support vector machine and radial basis function artificial neural network were used to establish the multivariate calibration models between the ultraviolet spectra and the contents of the nine components. The results showed that the established ultraviolet spectrum analysis method can determine the contents of the nine components in the distillates accurately， with root mean square error of prediction of 0.068， 0.147， 0.215， 0.319， 1.01， 1.27， 0.764， 0.147， 0.610 mg·L-1， respectively. This proposed method is a rapid， simple and low-cost tool for the monitoring and endpoint determination of the extraction process of Xingnaojing injection to reduce quality defects and variations.

[Key words] Xingnaojing injection； ultraviolet spectroscopy； process analysis； Curcumae Radix； Gardeniae Fructus； hydrodistillation； least squares support vector machine； radial basis function artificial neural network

醒腦静注射液是由麝香、郁金、栀子、冰片4味中药制成的注射剂，具有清热泻火、凉血解毒、开窍醒脑的功效，临床上主要用于中风、脑缺血、意识障碍、急性酒精中毒等病症^[1-2]，是年销售额超20亿元的中药大品种。该注射液生产中采用水蒸气蒸馏法对药材中挥发性成分进行提取。首先将郁金、栀子加水进行第一次蒸馏提取，收集蒸馏液，然后将麝香加入蒸馏液中，并加水进行第二次蒸馏提取。以水蒸气蒸馏法提取这些药材中的挥发性成分具有杂质提取量少的优点，但生产中存在提取时间长、能耗高、提取物批次间质量差异大等问题。

目前对醒脑静注射液的分析方法研究主要集中于成品质量检测^[3-5]，测定麝香酮、龙脑以及源于郁金的倍半萜类生物活性成分^[6]，如莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮等^[4]。此外，本课题组前期研究发现醒脑静注射液中源于栀子的2种主要成分为异佛尔酮和4-亚甲基-异佛尔酮，并建立了高效液相色谱（HPLC）分析方法用于测定一次提取过程中间体（即郁金-栀子蒸馏液）中源于栀子的这2种成分及源于郁金的7种倍半萜类成分（莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇、吉马酮）^[7]。

对于醒脑静注射液生产过程分析方法目前尚无文献报道，而为了合理判断提取过程终点，提升生产过程质量监控水平，需要研究并建立提取过程分析方法。紫外光谱（UV）是一种快速、无损的分析方法，与近红外光谱、拉曼光谱等相比，具有灵敏度高、仪器价格便宜的优点^[8]，已被用于多种中药的生产过程分析^[8-10]。由于郁金-栀子蒸馏液中待测成分浓度较低，因此本研究选择紫外光谱分析技术，建立蒸馏提取液中各成分含量与紫外光谱间的定量校正模型，以快速测定异佛尔酮、4-亚甲基-异佛尔酮、莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇、吉马酮9种成分的含量。在建立校正模型时，对偏最小二乘（PLS）、最小二乘支持向量机（LS-SVM）和径向基人工神经网络（RBF-ANN）3种建模方法进行比较并优选校正模型。本研究建立的分析方法具有快速、简便、低成本的优点，可用于提取过程监测和提取终点判断，以提高生产效率、减少产品质量缺陷和质量差异。

1 材料

栀子（产地浙江，批号151201）、郁金（产地浙江，批号160301）购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，并经浙江中医药大学杨波副教授鉴定为Gardenia jasminoides Ellis果实和温郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling块根。色谱纯乙腈、甲醇购自美国Tedia公司。色譜纯磷酸购自天津赛孚瑞科技有限公司。超纯水由UPH-III-5T型优普超纯水制造系统（成都超纯科技有限公司）产生。莪术二酮对照品（批号150610）购自成都植标化纯生物技术有限公司。

2 方法

2.1 水蒸气蒸馏提取与样品收集 郁金、栀子药材分别粉碎、过筛至20～80目，各取30 g粉末，加蒸馏水1 500 mL，浸泡12 h，以水蒸气蒸馏法进行提取^[11]。待药液沸腾，开始计时，在第15，30 min分别在冷凝管出口处接取5 mL蒸馏液样品，之后每隔30 min取样5 mL，至蒸馏液总体积（包含取样体积）为1 000 mL时停止取样。按上述条件开展10个正常批次提取实验。

为了扩大样品中各成分含量变化范围，同时为了考察所建立的分析方法在异常提取条件下是否适用，开展6个异常批次提取实验，对提取条件进行的改变见表1。批次11药材颗粒大小异常（10～20目），批次12药材提取前未浸泡，批次13，14提取溶剂异常，批次15药材投入量错误，批次16加热功率异常。共开展16个批次实验，取样166份。

2.2 高效液相色谱分析 采用本课题组建立的一测多评方法^[7]，以莪术二酮为内参物对照品，测定样品中9种成分含量。仪器为Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）。使用迪马钻石C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）。以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸-水溶液为流动相B。梯度洗脱（0～10 min，30%～55% A；10～24 min，55% A；24～35 min，55%～70% A；35～40 min，70%～100% A）。流速0.6 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量50 μL。使用二极管阵列检测器采集200～400 nm光谱，用于各成分定量的波长为：异佛尔酮238 nm，4-亚甲基-异佛尔酮275 nm，莪术双环烯酮256 nm，莪术烯醇261 nm，莪术二酮220 nm，莪术酮274 nm，莪术呋喃二烯酮274 nm，莪术醇210 nm，吉马酮210 nm。

上述HPLC分析方法在方法学考察中显示了良好的线性（线性相关系数r均大于0.999 9）、精密度（RSD均小于1.8%）、重复性（RSD均小于2.0%）、准确性（各成分加样回收率在95.30%～105.4%），且样品在12 h内稳定，表明该HPLC方法能准确地测定9种成分含量^[7]。

2.3 紫外光谱分析 使用UV-2600紫外光谱仪（上海尤尼科仪器有限公司）测定样品的紫外光谱。以蒸馏水为参比，波长范围为200～400 nm，波长间隔1 nm，共201个波长点。石英比色皿光程为2 mm，该光程能使大部分样品的吸光度最大值在0.3～1.0，因此不需要对样品进行稀释。由于紫外光谱测定重复性很好，每个样品只扫描一次紫外光谱。

2.4 校正模型的建立及其参数优化 以9种成分的HPLC测定值作为参考值Y，各波长下的吸光度作为自变量X，采用文献[12]中SPXY算法将全部样本划分为训练集（111个样本）和预测集（55个样本）。分别采用PLS，LS-SVM和RBF-ANN方法对训练集样本数据建立多元校正模型，并用预测集评价模型预测能力。建模时使用7-fold交叉验证，并以交叉验证误差均方根（RMSECV）为指标对各模型参数进行优化。考察的光谱预处理方法包括无预处理、标准化预处理（即通过预处理使各变量均值为0、标准差为1）、Savitsky-Golay平滑一阶导和平滑二阶导（窗口大小为7，3阶多项式）。PLS建模使用自编的Matlab程序，并对模型中的主成分数进行优化。LS-SVM建模使用LS-SVMlab 1.8工具箱^[13]，采用径向基核函数，以单纯形法对参数σ2和正则化参数γ进行优化。RBF-ANN建模使用Matlab自带的神经网络工具箱，将拟合误差均方根（RMSEC）的目标设为0，隐含层神经元个数最大值设为30，对径向基核函数扩展系数（spread）进行优化。以拟合相关系数（Rcal）、RMSEC、交叉验证相关系数（Rval）和RMSECV为指标评价建模效果。以预测相关系数（Rpred）和预测误差均方根（RMSEP）为指标评价模型预测能力。以样本标准差与RMSEP的比值，即剩余预测偏差（residual predictive deviation，RPD），评价模型预测误差的相对大小。全部数据处理均在Matlab 7.9软件（美国Mathworks公司）中进行。

3 结果与讨论

3.1 样品的紫外光谱 测得全部样品的紫外光谱见图1，郁金-栀子蒸馏液在200～300 nm紫外吸收较强，在380 nm以上吸光度趋于0。

3.2 多元校正模型的建立与评价 采用PLS，LS-SVM，RBF-ANN分别对9种成分进行建模，当RMSECV达到最小时，最佳的光谱预处理方法和模型参数见表2～4。各模型的Rcal和Rval基本都在0.9以上，且各成分浓度变化范围远大于RMSEC和RMSECV，表明建模效果良好。此外，虽然有文献报道通过剔除异常样本或剔除无效的光谱信息变量（即建模波段选择）可进一步改善建模效果，但本研究中并未发现明显异常的样本，且对紫外波段进行初步优选后建模效果并未得到明显改善，所以本研究使用200～400 nm全波段进行建模，且没有剔除异常样本。

根据RMSECV确定的9种成分最佳校正模型及其参数见表5。除了4-亚甲基-异佛尔酮和莪术双环烯酮的最优模型为RBF-ANN外，其余成分的最优模型均为LS-SVM。各成分的RMSEP均小于RMSECV，表明模型具有较好的预测能力，未出现过拟合现象。除吉马酮以外，其他成分的Rpred都在0.875以上。而吉马酮的Rpred偏低的原因在于，预测集中吉马酮含量变化范围相对训练集小了很多，虽然RMSEP只有0.610 mg·L-1，但相对该含量变化范围显得略大，对于训练集中吉马酮的含量变化范围，该预测误差已足够小。另外，由表5可见，除莪术呋喃二烯酮的RPD略小于3以外，其余8个成分的RPD均大于3，表明模型的预测误差相对于浓度变化范围足够小，模型准确度较好，可用于实际分析。

本研究建立的UV分析方法测定值与HPLC测定值之间的相关性，见图2，图中训练集样本的纵坐标为交叉验证值，预测集样本的纵坐标为预测值。2种分析方法间相关性良好，说明本研究建立的方法可在一定程度上代替HPLC分析，在生产过程中快速测定各成分含量。

3.3 快速分析方法在提取过程中的应用 采用本研究建立的UV快速分析方法对不同工艺条件下各成分提取情况进行监测。以批次1（正常批次）与批次11（药材颗粒偏大批次）为例进行了比较，见图3，当药材颗粒偏大时，提取液中莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、吉马酮的含量明显偏低，原因可能是这些成分亲水性相对较弱，从药材内部扩散到表面是其提取过程中的限速步骤，大颗粒药材中这些成分扩散相对较慢。本研究建立的分析方法能有效地区分正常和异常操作批次，可用于提取过程监测。

4 结论

醒脑静注射液提取过程分析方法的建立有助于解决其提取时间长、提取物批次间质量差异大等问题。本研究基于紫外光谱建立了醒脑静注射液一次提取过程分析方法，能快速、准确地对蒸馏液中异佛尔酮、4-亚甲基-异佛尔酮、莪术双环烯酮、莪术烯醇、莪术二酮、莪术酮、莪术呋喃二烯酮、莪术醇、吉马酮9种成分进行含量测定。该方法与传统色谱分析方法相比，具有操作简便、不破坏样品、无需样品预处理、不消耗化学试剂、分析成本低的优势，可用于醒脑静注射液的工业生产过程，有助于实现提取过程的可视化。

[参考文献]

[1] 华承磊， 叶建新. 醒脑静注射液的临床治疗现状[J]. 中国中医急症， 2011， 20（4）： 626.

[2] Wei G， Huang Y， Li F， et al. XingNaoJing， prescription of traditional Chinese medicine， prevents autophagy in experimental stroke by repressing p53-DRAM pathway[J]. BMC Complement Altern Med， 2015， 15（377）： 1.

[3] 杨立新， 冯伟红， 夏伯候， 等. 醒脑静注射液HPLC特征图谱研究[J]. 中国中药杂志， 2016， 41（9）： 1640.

[4] Pan W， Yang L， Feng W， et al. Determination of five sesquiterpenoids in Xingnaojing injection by quantitative analysis of multiple components with a single marker[J]. J Sep Sci， 2015， 38（19）： 3313.

[5] 方颖， 赵希贤， 赵鸣舒， 等. 气相色谱法同时测定醒脑静注射液中麝香酮、龙脑、樟脑、异龙脑的含量[J]. 中国实验方剂学杂志， 2012， 18（8）： 96.

[6] Tao W， Xu X， Wang X， et al. Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Chinese herbal Radix Curcumae formula for application to cardiovascular disease[J]. J Ethnopharmacol， 2013， 145（1）： 1.

[7] Fang J， Yang B， Ge Z， et al. Single standard substance for the determination of nine volatile components in the distillate of Fructus Gardeniae and Radix Curcumae （an intermediate of Xingnaojing injection）[J]. J Sep Sci， 2017， doi： 10.1002/jssc.201700593.

[8] 严斌俊， 刘爽悦， 郭正泰， 等. 基于紫外光谱的丹红提取液质量快速分析技术[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（11）： 1676.

[9] Yan B， Qu H. Multivariate data analysis of UV spectra in monitoring elution and determining endpoint of chromatography using polyamide column[J]. J Sep Sci， 2013， 36（7）： 1231.

[10] 邢丽红， 李文龙， 瞿海斌. 金银花提取物中5种有机酸含量测定的紫外光谱法[J]. 药物分析杂志， 2011， 31（3）： 547.

[11] 國家食品药品监督管理局. 国家药品标准WS3-B-3353-98-2003[S]. 2003.

[12] Galvao R K H， Araujo M C U， Jose G E， et al. A method for calibration and validation subset partitioning[J]. Talanta， 2005， 67（4）： 736.

[13] Suykens J A K， Van Gestel T， De Brabanter J， et al. Least squares support vector machines[M]. Singapore： World Scientific， 2002.

[责任编辑 孔晶晶]