穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的制备构建及评价研究

2017-10-28焦莹巨红叶胡坤霞唐志书宋逍

中国中药杂志 2017年19期

关键词：评价

焦莹+巨红叶+胡坤霞+唐志书+宋逍

[摘要] 该文建立了热高压均质法制备穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的工艺方法，并对星点设计-响应面法优化其工艺处方进行了体外制剂学评价。结果显示按照星点设计-响应面法优化后的最佳工艺处方制备的穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体为类球形，粒径为（90.9±0.6） nm，多分散系数为（0.253±0.07），粒度分布均匀，Zeta电位为（-45.7±0.5） mV，包封率为（90.2±0.5）%，载药量为（23.30±0.10）%。结果表明热高压均质法制备的穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体具有良好的理化性质。

[关键词] 穿山龙薯蓣皂苷；纳米结构脂质载体；制备构建；评价

[Abstract] In this report， a heat and high-pressure homogenization method was used to prepare dioscin nanostructured lipid carriers， and the formulation of dioscin nanostructured lipid carriers was optimized by central composite design-response surface methodology. In vitro evaluation data showed that the preparation of dioscin nanostructured lipid carriers under optimal process by central composite design-response surface methodology had a spherical shape and homogeneous size distribution， with a particle size of （90.9±0.6） nm， a polydispersity index of （0.253±0.07）， Zeta potential of （-45.7±0.5） mV， encapsulation efficiency of （90.2±0.5）%， and the drug loading of （23.30±0.10）%. These results clearly indicate that the preparation of dioscin nanostructured lipid carriers made with the heat and high-pressure homogenization method have very good physical and chemical properties， suitable for therapeutic applications.

[Key words] dioscin； nanostructured lipid carrier； preparation and construction； appraise

穿山龍薯蓣皂苷（dioscin）是穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino根茎穿山龙中含量较为丰富的一类甾体皂苷，它是穿山龙主要的活性成分。相关文献报道^[1]，薯蓣皂苷具有抗肿瘤、抗血小板聚集、调节免疫、降低血脂、改善心血管功能等作用。另有研究者发现薯蓣皂苷可以抑制多种肿瘤细胞，如肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等^[2-4]。近几年关于薯蓣皂苷剂型的研究鲜有报道，尤其是其抗肝癌的药物剂型，故本实验欲将薯蓣皂苷制成抗肝癌的新型纳米制剂，进而能更好地发挥其抗肿瘤的作用。纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）作为继固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）之后的又一新的纳米给药系统，与SLN相比，NLC的载体材料中多了液体油相，它可以增加药物的溶解度，提高药物的包封率和载药量、增加活性物质的稳定性，并且NLC具有良好的靶向性，但同时也存在着不足，NLC制备过程中需要相对较高的温度和较高的分散性^[5-11]。因此，本实验采用热高压均质法结合星点设计-响应面法优化制备穿山龙薯蓣皂苷纳米制剂，以改善其溶解度和提高穿山龙薯蓣皂苷的口服生物利用度，增强其抗肝癌的靶向性，为穿山龙薯蓣皂苷新制剂的开发提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器

BT-25S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AR1140电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；HH-2型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；78-1磁力加热搅拌器（常州丹瑞实验仪器设备有限公司，金坛市双捷实验仪器厂）；FJ200-SH数显高速分散均质机（上海标本模型厂）；AH-BASICI 型高压均质机（ATS Engineering Inc. ATS工业系统有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ulti Mate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Zetasizer Nano 3600粒度电位仪（马尔文仪器公司）；JEM-1230透射电镜（JEOL.日本电子光学公司）。

1.2 试剂试药

薯蓣皂苷对照品（中国食品药品检定研究院，纯度96.2%，批号111707-201402）；穿山龙薯蓣皂苷提取物（南京春秋生物工程有限公司，HPLC检测纯度≥98%，批号SYZG20160413）；单硬脂酸甘油酯（GMS，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20150110）；大豆油（江西益普生药业有限公司，批号20160602）；聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80，天津市红岩化学试剂厂，批号20150508）；十二烷基硫酸钠（SDS，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体和空白NLC的制备精密称取处方量的GMS和大豆油，水浴加热至熔融，形成油相，加入适量的薯蓣皂苷提取物使溶解；另精密称取处方量的吐温80和SDS，加入一定体积的纯化水，用磁力搅拌器搅拌至2种乳化剂均匀分散在水中，并加热至与油相相同的温度，作为水相；然后立即将水相倒入油相中，搅拌均匀，用高速分散均质机剪切成初乳液，再将初乳液趁热倒入高压均质机内进行高压乳匀均质，即得到穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体溶液。同法制备不含有薯蓣皂苷提取物的NLC，作为空白NLC溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备精密称取薯蓣皂苷对照品3.00 mg，置于10 mL量瓶中，加入适量甲醇，摇匀，超声处理使溶解，冷却至室温，滴加甲醇定容至刻度，即得质量浓度为300 mg·L-1的薯蓣皂苷对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备精密量取穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体溶液 1 mL于10 mL量瓶中，加入适量甲醇，振摇，超声处理使其破乳，冷却至室温，滴加甲醇定容至刻度，摇匀，即得穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体供试品溶液。同法制备空白NLC供试品溶液。

2.2 含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件 Hypersil GOLD色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水（55∶45）为流动相，检测波长为203 nm，柱温为室温，进样量10 μL。理论塔板数按穿山龙薯蓣皂苷峰计不超过3 000。

2.2.2 专属性试验按照2.1.2项下方法制备薯蓣皂苷对照品溶液，按照2.1.3项下方法制备空白NLC溶液和穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体供试品溶液，分别用0.45 μm的有机微孔滤膜过滤，精密吸取续滤液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。空白NLC溶液对穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的检测无干扰，表明该方法专属性良好，见图1。

2.2.3 线性关系考察精密量取薯蓣皂苷对照品溶液适量，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，分别制得质量浓度为10，20，30，40，60，100，150，200，300，600 mg·L-1的一系列对照品溶液。再分别精密吸取各对照品溶液10 μL，按照2.2.1项下的色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定并记录峰面积。以薯蓣皂苷的浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程Y=36.501X-0.129 1，R2=0.999 1（n=3），结果表明薯蓣皂苷在10～600 mg·L-1和峰面积呈现良好的线性关系。

2.2.4 精密度考察分别精密吸取质量浓度为20，60，110 mg·L-1的薯蓣皂苷对照品溶液10 μL，按照上述色谱条件重复进样6次，测定其峰面积，计算其日内精密度RSD为1.0%，1.1%，1.1%；分别重复进样3 d，测定其峰面积，计算其日间精密度RSD为1.1%，1.9%，0.78%。结果表明仪器的精密度良好。

2.2.5 稳定性考察按最佳工艺处方制备穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体，分成若干份，放于4 ℃的环境中存放，于0，10，20，30 d分别取出1份测定其粒径、包封率和载药量，见表1。

根据实验结果显示，本实验所制备的穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体在30 d内稳定性良好。

2.3 包封率和载药量的测定

本实验采用超滤離心法^[12-14]测定穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的包封率和载药量。精密吸取穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体溶液 450 μL于超滤管内管（截留相对分子质量为3 000）中，将内管放入外管中，于1万 r·min-1离心40 min，精密吸取外管中滤液10 μL，注入高效液相色谱仪中进行测定，记录峰面积，并计算穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体溶液中的游离药物量W1；精密吸取穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体1 mL于10 mL量瓶中，加入适量的甲醇，振摇，超声处理（功率250 W，频率40 KHz）40 min，冷却至室温，加甲醇定容至刻度，摇匀，精密吸取续滤液10 μL注入高效液相色谱仪中，进行测定，记录峰面积，并计算穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体溶液的总药量W2，按下列公式计算包封率（ER）和载药量（DL），包封率（ER）=（W2-W1）/W2×100%，载药量（DL）=（W2-W1）/（W载体总量+W2）×100%，其中W1为游离药物量，W2为溶液中的总药量，W载体总量为处方中除了药物以外所有辅料的质量。

3 工艺处方优选

3.1 处方筛选

本实验将粒径、Zeta电位、包封率和载药量作为穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的质量评价指标，分别考察了液体脂质占比、脂质总质量分数（投药量较少，载药量较低，未列出），复合乳化剂用量、复合乳化剂吐温80与SDS比例及药物量对穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径、Zeta电位、包封率和载药量的影响，从而确定星点设计中4个影响较大的考察因素的取值范围，为响应面法优化提供参考依据。

3.1.1 液体脂质占比的影响固定脂质总质量分数为6%，考察大豆油量占脂质总质量分数的0%，10%，20%，30%，40%时对穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径、Zeta电位和包封率的影响。结果见表2。

从实验结果可以看出，当大豆油量占脂质总质量分数的20%时，粒径相对较小，Zeta电位的绝对值较大，稳定性相对较好，而且包封率也最高，因此本实验将大豆油量控制在脂质总质量分数的20%。

3.1.2 脂质总质量分数的影响固定大豆油量为脂质总质量分数的20%，考察脂质总质量分数为2%，4%，6%，8%，10%时对穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径、Zeta电位和包封率的影响，见表3。

当脂质总质量分数为4%～8%时，穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的包封率较高，粒径较小，粒度分度相对比较均匀，Zeta电位的绝对值较大，稳定性较好，故本实验中选择脂质总质量分数4%～8%为星点设计-响应面优化中考察因素的考察范围。

3.1.3 复合乳化剂用量的影响本实验选取吐温80和SDS作为制备穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的复合乳化剂。固定脂质总质量分数为6%、液体油相占脂质总质量分数的20%，分别考察不同质量分数（0.2%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）的复合乳化剂对穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径、Zeta电位、包封率和载药量的影响，见表4。

结果表明，随着复合乳化剂浓度的增加，穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径、包封率和载药量均是先增大后减小，当浓度为0.5%～1.5%时，穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径相对较小，包封率和载药量相对较高，因此本实验将复合乳化剂用量设为0.5%～1.5%作为星点设计-响应面优化考察因素的取值范围。

3.1.4 吐温80与SDS二者比例的影响固定脂质总质量分数为6%、液体油相占脂质总质量分数的20%，复合乳化剂用量为1%，分别考察复合乳化剂二者比例（吐温80-SDS）为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4时对穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径、Zeta电位、包封率和载药量的影响，见表5。

从实验结果中得知，当复合乳化剂二者比例为2∶1～1∶1时，穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径相对较小，包封率和载药量相对较高，因此将二者比例设为2∶1～1∶1作为星点设计-响应面法优化中考察因素的考察范围。

3.1.5 药物量的影响固定脂质总质量分数为6%、液体油相占脂质总质量分数的20%，复合乳化剂用量为1%、复合乳化剂吐温80与SDS二者比例为2∶1，考察当投药量为5，10，20，40，80 mg时穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径、Zeta电位、包封率和载药量的影响，见表6。

从实验结果可以得知，当药物量为20，40 mg时，穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径相对较小，包封率较高，载药量相对较好，故本实验将药物量控制在20～40 mg，作为星点设计-响应面法优化考察因素的考察范围。

3.2 工艺设计及优化

3.2.1 工艺设计根据单因素考察结果，本实验选择了对制备工艺影响较大的4个因素作为考察因素，即：药物量（A）、脂质总质量分数（B）、复合乳化剂用量（C）、吐温80与SDS比例（D），每个因素分别设置5个水平：0，±1，±α（α=1.682），因素与水平见表7，选取粒径（R1）、包封率（R2）、载药量（R3）为考察指标，通过星点设计-响应面法^[15-21]对该工艺进行优化筛选。星点设计方案及结果见表8。

将R1，R2，R3 3个考察指标采用Hassan方法进行归一化（0～1），通过其归一值（OD，OD=kd1d2d3…dk，k为指标数）对其进行质量评价，并筛选出最优工艺处方。方差分析见表9。

3.3 处方验证试验

依照星点设计-响应面法优化后的工艺处方，制备3批穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体样品，分别测定穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体的粒径（R1）、包封率（R2）和载药量（R3），与模型预测值比较，见表10。

该结果表明优化后的工艺处方即可制备出重复性良好的穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体，即该处方为最佳工艺处方。

3.4 形态学考察

室温环境下，吸取穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体溶液适量，加纯水稀释50倍，摇匀，吸取10 μL滴至铜筛网上，2 min后用滤纸吸去多余的液体，滴加2.0%磷钨酸钠负染液，负染1.5 min后用濾纸吸去多余的负染液，自然晾干后，在透射电镜下观察穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体溶液的形态并拍摄照片，见图3。

结果显示，穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体溶液的粒子呈类球形，大小均一，分散均匀，粒径大约在80～110 nm。

3.5 粒径、多分散系数（PDI）和Zeta电位的测定

按照最佳工艺处方制备穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体，平行制备3份，摇匀，吸取适量溶液置于粒度测定仪中，分别测定其粒径、多分散系数及Zeta电位，平行测定3次，见图4，5。

4 结语

穿山龙薯蓣皂苷属于难溶性药物，它具有抗炎、降血脂、保肝、抗肿瘤、抗病毒、改善心血管功能等作用，本课题前期预实验表明穿山龙薯蓣皂苷具有良好的抗肝癌作用，故本实验将其制成新型纳米给药系统——NLC，一方面可以增加它的溶解性，提高其口服生物利用度，提高药物的包封率和载药量，增加活性物质的稳定性；一方面，与传统的纳米给药系统相比，NLC具有较好的靶向性，将穿山龙薯蓣皂苷制成纳米结构脂质载体，可以更好地发挥穿山龙薯蓣皂苷的抗肝癌作用。

NLC是在SLN的基础上发展起来的一种新型纳米给药系统，它的不同在于，在SLN的组成中加入了与固体脂质化学性质差异较大的液体油相，液体油相与固体脂质的结合使得纳米给药系统产生晶格缺陷，从而使难溶性药物能够很好地存在晶格内部，进而提高难溶性药物的包封率和载药能力，降低活性物质在储藏过程中的泄漏率^[22-27]。

本实验在单因素考察中选择复合乳化剂时，发现蛋黄卵磷脂、吐温80和SDS对穿山龙薯蓣皂苷的溶解性较好，但是蛋黄卵磷脂在常温下的吸湿性很强，对剂型的制备会有一定的影响，因此本实验采用吐温80和SDS作为复合乳化剂。通过单因素考察确定各个因素的取值范围，利用Design-Expert 8.0.6软件对其工艺进行星点设计-响应面优化，结果表明最佳工艺处方制备的穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体具有较小的粒径、较高的包封率和载药量。NLC的稳定性主要取决于其Zeta电位值，Zeta电位的绝对值>30 mV时，认为NLC体系是稳定的。穿山龙薯蓣皂苷纳米结构脂质载体Zeta电位的绝对值均大于30 mV，表明所制备的剂型稳定性良好。后续本课题将对穿山龙薯蓣皂苷提取物和其纳米新制剂同时进行体内研究，进一步说明将穿山龙薯蓣皂苷制成新型纳米制剂可以提高其口服生物利用度，同时可以更好地靶向作用于肝癌细胞，进而确定其抗肝癌的作用，为临床上穿山龙薯蓣皂苷抗肿瘤的研究提供基础。

[参考文献]

[1] 许丽娜，卫永丽，彭金咏，等.天然产物薯蓣皂苷的研究进展[J]. 中国中药杂志，2015，40（1）：36.

[2] 杜虹韦.穿龙薯蓣与盾叶薯蓣研究开发概况[J]. 中医药学报，2010，38（3）：131.

[3] 时光霞，刘郁.穿山龙超声波醇提工艺研究[J]. 海峡药学，2014，26（12）：75.

[4] 陈信义，高志捷，王玉芝.薯蓣皂苷抗移植性小鼠乳腺癌作用的研究[J]. 中国中医药信息杂志，2005，12（5）：23.

[5] 孙远南.新型纳米给药系统-纳米结构脂质载体的研究进展[J]. 海峡药学，2010，22（11）：13.

[6] 宋春晓，何书莲，曹春凤，等.固体脂质纳米粒和纳米结构脂质载体在药物传递中的研究进展[J]. 药学研究，2016，35（4）：234.

[7] 张坤驰，吕邵娃，王艳宏，等.新型纳米结构脂质载体的制备及应用研究进展[J]. 中成药，2013，35（2）：368.

[8] 温许，胡雄伟，吴昊，等.纳米结构脂质载体用于难溶性药物口服传递的研究进展[J]. 药学实践杂志，2012，30（4）：254.

[9] 黄霞，陈卫东.固体脂质纳米粒和纳米脂质载体二类脂质纳米给药系统的比较[J]. 中国药学杂志，2012，47（17）：1350.

[10] 李艳芝，祁荣，柯学.纳米脂质载体应用于口服给药系统的研究紧张[J]. 药学与临床研究，2013，21（4）：355.

[11] 刘建清，张晶，赵佳丽，等.纳米结构脂质载体促进难溶性药物口服吸收机制的研究进展[J]. 药学实践杂志，2014，32（4）：254.