密银花对照药材标定标准的研究

2017-10-28杨健蒋超金艳赵玉洋袁媛黄璐琦

中国中药杂志 2017年19期

杨健+蒋超+金艳+赵玉洋+袁媛+黄璐琦

[摘要] 建立道地药材密银花对照药材标定技术规范，作为密银花对照药材内在质量控制和评价的理论依据及技术标准，为道地药材现代研究及其特征辨识提供支撑。收集10批密银花，根据2015年版《中国药典》一部方法进行检验，10批样品均符合规定；建立LC-MS指纹图谱检测方法，确定了23 个共有峰，并根据对照品和参考文献指认了8个共有峰，对10批密银花药材相似度进行了考察，其相似度在0.95以上。使用7对金银花种质鉴定核心引物进行SSR指纹图谱构建，10批密银花指纹图谱均与河南尖山大毛花种质SSR参照图谱差异位点数为1或0个，符合密银花种质分子特征。通过结合DNA指纹图谱和LC-MS化学指纹图谱，建立了首个中药道地药材的标定标准，该标定标准的制定为加快中药标准药材尤其是道地药材的评价体系的建设提供了理论依据及技术标准。

[关键词] 金银花；密银花；道地药材；指纹图谱

[Abstract] The calibration technical specification for reference drug of Lonicera japonica cultivated in Xinmi （Mi Yin Hua） established in this study can be used as the theoretical basis and technical standard for internal quality control and evaluation of reference drug of Mi Yin Hua and for modern research and characteristics identification of Dao-di herbs. Based on the quality standard of L. japonica in Chinese Pharmacopoeia （version 2015）， 10 batches samples of Mi Yin Hua also conformed to the stipulation. The LC-MS fingerprint common mode of Mi Yin Hua was obtained， and a total of 23 characteristic peaks were selected as the common fingerprint peaks， and eight common chromatographic peaks in the fingerprint was identified based on standard substances and references. The similarities of 10 batches samples were greater than 0.95. Seven core primers were used to construct SSR fingerprint and the ten batches samples were only 0 or 1 site disaccord with the standard diagram of Jianshan Damaohua germplasm from Xinmi. This paper constructed the first calibration standard of Dao-di herbals by combination of macroscopical identification， SSR fingerprint and LC-MS fingerprint， and the calibration standard provide theoretical basis and technical standard for evaluation system of Dao-di herbals.

[Key words] Lonicera japonica； Mi Yin Hua； Dao-di herbs； fingerprint

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、凉散风热的功效^[1]。金银花是常用大品种中药材，主產于河南、山东、河北等省，其中河南“密银花”是被广泛认可的道地药材。早在南宋，《曲洧旧闻》中就明确记载金银花产于“郑许田野间”^[2]，郑许即南宋时期的郑州和许州，其与现今河南省郑州市、许昌市位置大致相当。而《救荒本草》记载金银花生于“辉县山野中”^[3]，明代辉县与今之河南省辉县市位置也大致相当。《植物名实图考》记载金银花“皆中州产也”，这里的中州即指今河南省。由此可见，宋、明、清三代均有文献明确记载河南产金银花，且《植物名实图考》中提到“茶肆以新贩到金银花为贵，皆中州产也”^[4]，可依此判断当时已经认为河南的金银花是质优效佳之品。密银花的明确记载已从南宋延续至今，古代本草中比较明确的产地有河南省的郑州市、许昌市和辉县市，位于东经115°北纬35°左右的区域。

道地药材是中医药伟大宝库中重要的组成部分，在国家药品标准物质要求的基础上，建立对照道地药材是实现道地药材特征辨识的必要前提。对道地药材的评价应是在符合《中国药典》要求的基础上，对优质药材进行鉴定与评价，但现有的化学对照品、对照药材等标准物质已不能满足道地药材评价的需求，因此需要建立更高要求的标准物质。本研究采集来自金银花传统道地产区——河南省新密市的10批密银花，分析研究各批次样品的特征特性，建立密银花的DNA指纹图谱和LC-MS化学指纹图谱，制定了密银花对照药材标定技术标准，作为密银花对照药材内在质量控制和评价的理论依据及技术标准，为道地药材现代研究及其特征辨识提供支撑。endprint

1 材料

ACQUITY UPLCTM I-Class超高效液相色谱系统（美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站），Xevo G2-XS QTOF四极杆-飞行时间质谱仪（美国Waters公司，ESI电喷雾离子源），SB-800 DTD型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司），New Classic MS-S电子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]，Eppendorf 5810R离心机（德国Eppendorf公司）。

ABI 9700 PCR仪（ABI公司），DYY-12电泳系统（北京市六一仪器厂），GBOXHR紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene公司），MM400混合型球磨仪（德国Retsch公司），Eppendorf微量移液器（德国Eppendorf公司），HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），CSIOI-1D电热鼓风干燥箱（中国重庆实验设备厂），AMFI-5-P实验室级专用纯化水机（颐洋企业发展有限公司），Bio-rad电泳仪（美国Bio-Rad公司），MDF-192低温冰箱（日本 SANYO公司）。

色谱甲醇和色谱乙腈（美国Fisher Scientific公司）；甲酸（LC-MS分析用，美国Fisher Scientific公司），15 mL离心管（NEST），0.22 μm PTFE滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

对照品绿原酸（批号110753-201505）、木犀草苷（批号111720-201609）及对照药材金银花（批号121060-201608）均购自中国食品药品检定研究院；对照品新绿原酸（批号B213963-201507）、四乙酰开联番木鳖苷（批号B25441-201503）、马钱苷（批号B20822-201503）、獐牙菜苷（B21643-201507）、断氧化马钱子苷（B30116-201503）、异槲皮苷（B21529-201509）、异绿原酸 A（B21539-201503）均购自上海源叶生物科技有限公司。

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、聚乙烯比咯烷酮-40 （PVP-40）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺、N，N，-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）均购自Amersco公司、硝酸银购自中国医药集团。

琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka公司），DNA Taq聚合酶（Takara公司），500 bp DNA Markar（Takara公司），引物（生工（北京）有限公司合成），溴酚蓝（上海生物工程公司），TEMED，β-巯基乙醇，三氯甲烷（天津市永大化学试剂有限公司），甲醛（天津市永大化学试剂有限公司），无水乙醇（天津市永大化学试剂有限公司），异丙醇（天津市永大化学试剂有限公司），异戊醇（天津市永大化学试剂有限公司）均为国产分析纯等。

本实验所用密银花药材（10批）于2014年5月采自河南省郑州市新密市尖山乡，生长环境为山地，阳坡，土壤为砂壤土，自然降水（图1）。GPS信息为，纬度34° 36′ 30.3″，经度113° 17′ 12.2″，高度 551 m，符合古代本草明确记载密银花产地；由河南中医药大学陈随清教授鉴别，符合传统密银花性状特征。

2 方法与结果

2.1 《中国药典》2015年版一部金银花项下的项目的检验

性状鉴定、显微和薄层色谱鉴别、水分、总灰分及酸不溶性灰分、重金属及有害元素、绿原酸和木犀草苷的含量测定按《中国药典》2015年版一部金银花项下的规定检验^[5]，10批次样品均符合规定。

2.2 道地药材性状特征

花蕾呈棒状，无开朵，表绿白色，密被短柔毛，质稍硬，用手均匀撒下，花与花可搭成十字架；气清香，味淡，微苦，具有明显的传统密银花性状特征^[6-7]。

2.3 DNA指纹图谱研究

2.3.1 总DNA提取

用硅胶干燥材料，用改良CTAB 法提取总DNA^[8]。测量总DNA的吸光度A并经1%琼脂糖凝胶电泳检测，放置于-20 ℃冰箱中保存备用。

2.3.2 DNA身份证

利用 7 对金银花种质鉴定核心引物（A，B，C，D，E，F，G），进行PCR扩增^[9]（表1）。

PCR反应体系（25 μL）为：19.8 μL ddH2O，2.5 μL 10×PCR buffer，1 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，10 μmol·L-1上下游引物各0.25 μL，2.5 U rTaq DNA聚合酶[寶生物工程（大连）有限公司]0.2 μL，1 μL 50～100 mg·L-1DNA模板。反应在ABI公司的9700型PCR扩增仪上进行，反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，46～51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。反应结束后，扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测多态性条带（图2）。

通过与标准指纹图谱对比，获得DNA身份证：A11010000B00000100110C0001010D010011E10111011110F000000110G00010101。采用引物对16扩增得到的电泳图谱中的特异性条带为（450±5），250，230，（160±5） bp；采用引物对17扩增得到的电泳图谱中的特异性条带为220，150，140，（130±5） bp；采用引物对18扩增得到的电泳图谱中的特异性条带为230，200，160 bp；采用引物对23扩增得到的电泳图谱中的特异性条带为（600±10），280，270，170，（160±5） bp；采用引物对24扩增得到的电泳图谱中的特异性条带为（550±5），350，300，（280±5），250，240，220，190 bp；采用引物对29扩增得到的电泳图谱中的特异性条带为200，（170±5），（150±5） bp；采用引物对30扩增得到的电泳图谱中的特异性条带为280，260，（235±5），（220±5） bp；所测样品SSR指纹图谱与河南尖山大毛花种质SSR参照图谱差异位点数为1或0个，符合密银花种质分子特征。endprint

2.4 LC-MS特征图谱的研究

2.4.1 对照品溶液制备

分别取绿原酸、新绿原酸、裂马钱苷、马钱苷、獐牙菜苷、断氧化马钱子苷、异槲皮苷和异绿原酸 A适量，精密称定，加甲醇分别制成约100 mg·L-1的对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液制备

称取密银花样品粉末（过4号筛）0.5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，加入70%乙醇溶液50 mL，超声处理（功率 140 W，频率 42 kHz）30 min；放冷，再称重，70%乙醇补足失重，摇匀，以1万 r·min-1离心15 min，取上清液0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4.3 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC T3色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，Waters，USA），流动相0.1%甲酸-水溶液（A） - 0.1%甲酸-乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，5%～10% B； 3～13 min，10%～40% B； 13～18 min，40%～80% B），流速0.50 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量1 μL。

2.4.4 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；负离子模式采集数据；质量扫描范围m/z 100～1 500；干燥气体：氮气，流量6 L·min-1；干燥气温度220 ℃；毛细管电压（capillary voltage） 4.0/5.5 kv （+/-）；锥孔电压（sampling cone） 35/50 eV （+/-）；萃取锥孔（extraction cone） 3 eV；离子源温度（source temperature） 100 ℃；脱溶剂气温度（desolvation temperation） 350 ℃；反向锥孔气流（cone gas flow） 50 L·h-1；脱溶剂气（desolvation gas flow） 650 L·h-1；低质量区分辨率（LM resolution） 4.7 eV；高质量区分辨率（HM resolution） 15 eV；碰撞气体氩气，碰撞能量10 eV；碰撞池入口（collision cell entrance） 2 eV；碰撞池出口（collision cell exit） -10 eV；碰撞气流速（collision gas flow） 0.5 mL·min-1；碰撞能量：低能量6 V，高能量20～60 V。

2.4.5 方法学考察

2.4.5.1 精密度试验精密吸取同一S1样品供试品溶液，上述色谱和质谱条件下连续重复进样 6 次，测得各共有峰的相对保留时间RSD<0.69%，各共有峰相对峰面积RSD<2.1%，表明进样和仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.5.2 稳定性试验取同一S1样品供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12 h按上述色谱和质谱条件进行检测，各共有峰相对保留时间RSD<1.1%，各共有峰相对峰面积RSD<2.4%，表明样品溶液在12 h内稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.5.3 重复性试验取S1样品粉末 6 份，按2.4.2项方法分别制备供试品溶液，再按上述色谱和质谱条件进行检测，各共有峰相对保留时间RSD<1.4%，共有峰相对峰面积RSD<2.9%，表明方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.6 指纹图谱的建立与共有峰的确定

按2.4.2项下方法制备10批次的密银花供试品溶液，2.4.3项色谱条件及2.4.4项质谱条件下测得密银花UPLC-MS指纹图谱。比较10批供试品的色谱图，确定了 23 个共有峰（图2）。通过UPLC-MS/MS离子扫描获得的指纹图谱结构信息并结合对照品进行指认，确定其中8个指纹成分的化学结构，分别为1（新绿原酸）、3（绿原酸）、4（四乙酰开联番木鳖苷）、5（马钱苷）、7（獐牙菜苷）、9（断氧化马钱子苷）、10（异槲皮苷）和12（异绿原酸 A）。

以3号峰（绿原酸）作为参照峰，计算各指纹峰面积与同一图谱中参照峰的峰面积比值，得到相对峰面积；将所得10批密银花药材的上述信息数据依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A 版），产生对照图谱，经多点校正及色谱峰匹配得出不同密银花药材的相似度（表2）。10批密银花药材的相似度结果均大于0.95，说明10批密银花药材的代谢轮廓比较接近，区域内药材质量差异较小，化学成分比较稳定。

3 讨论

本研究在《中国药典》2015年版一部金银花标准的基础上，增加了DNA指纹图谱和LC-MS化学指纹图谱，按拟定的标准检测10批密银花药材，结果表明该标准适宜作为道地药材密银花对照药材的标定标准。作为首个中药道地药材的标定标准，该标定标准的制定为加快中药标准药材尤其是道地药材的评价体系的建设提供了理论依据及技术标准，为道地药材现代研究及其特征辨识提供技术支撑。

双分子标记是基于 DNA分子标记和代谢标识物相结合的分析方法，在分子水平同时研究中药的种类、区别和质量差异的一种分子标记方法^[10]。双分子标记技术利用DNA分子标记分析中药物种的遗传信息分析，代谢标识物的定性及定量进行中药物质基础的评价，从而达到中药“真伪、优劣”二维分子评价的目的。本研究使用双分子标记的方法同时从遗传指纹和代谢标识指纹图谱2个方面对道地药材密银花进行标定，从而确定其标定标准。

本研究通过采用UPLC-MS/MS技术建立了道地密银花药材的总离子流色谱指纹图谱，选择质谱（MS）作为样品测定的检测器，可以有效的克服紫外检测器（UV）的局限性以及蒸发光散射检测器（ELSD）的不稳定性，并且其具有更加准确的定性能力，能够最大限度的反应药材的化学指纹特性。

通过使用SSR指纹图谱作为DNA分子身份证，使用7对核心引物标定10批密银花药材，其SSR指纹图谱结果均与河南尖山野生金银花种质SSR参照图谱差异位点≤1个，表明通过SSR指纹图谱技术能准确标定道地药材密银花的DNA特征，结合化学指纹图谱形成的双分子标记可准确标定中药材，建立道地药材标定标准。

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