CotA漆酶的固定化及其对溴麝香草酚蓝脱色的效果1)

邢丹 马铭鸿 吴航伸 孙海琼 王珏玉 汪春蕾 赵敏

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

CotA漆酶的固定化及其对溴麝香草酚蓝脱色的效果1)

邢丹 马铭鸿 吴航伸 孙海琼 王珏玉 汪春蕾 赵敏

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

将林地土壤中分离的枯草芽孢杆菌中克隆的CotA漆酶基因，在毕赤酵母菌中进行表达；以海藻酸钙为载体，采用包埋法固定毕赤酵母菌表达的CotA漆酶，固定化效率为32.2%，正交试验优化后的固定化效率比优化前提高了30.1%。优化了游离CotA漆酶及固定化CotA漆酶对溴麝香草酚蓝的脱色条件，在30 min内，固定化CotA漆酶在70 ℃、pH为8.0时，游离CotA漆酶在60 ℃、pH为7.6时，对溴麝香草酚蓝溶液的脱色率最高，分别达到76.81%和67.12%，说明固定化CotA漆酶比游离CotA漆酶在较高温度和碱性条件下活性更高。

CotA漆酶；溴麝香草酚蓝；染料脱色

溴麝香草酚蓝(BTB)是结构比较稳定的杂环类染料[1-2]，应用于植物性别鉴定[3]、食品中铅的检测[4]、种子生活力的检测[5]等方面，并作为生物反应的指示剂而被大量使用。染料不仅对水体的溶氧度和可视度造成影响，还会被降解成联苯胺等致癌物质，因此印染废水的处理备受关注[6-8]。漆酶能够使多种染料脱色，与介体联用或与固定化酶技术相结合，使其应用范围更广[9-10]。真菌漆酶广泛应用于染料脱色，但大多数真菌漆酶只在酸性条件下具有活性，且热稳定性较差[11]。而一般工业印染废水具有高温、高pH和高盐等特点[12]，真菌漆酶在处理工业印染废水时容易失活，而不能起到很好的作用。与真菌漆酶相比，细菌漆酶具有热稳定性好及耐碱性等优点，在印染废水处理领域比真菌漆酶具有更好的应用优势[13]。

固定化酶技术是指通过物理或者化学方法，将酶固定在载体上，使酶的稳定性增强，且适应条件更广，同时还实现了酶的循环利用，节约了成本[14]。海藻酸钠是一种线性的天然生物大分子，具有生物可降解性、生物相容性及生物黏附性，广泛地应用于酶及细胞的固定化研究中。本研究利用海藻酸钠和氯化钙形成的海藻酸钙固定CotA漆酶，优化固定条件，并利用游离的和固定化的CotA漆酶，分别对溴麝香草酚蓝(BTB)溶液进行脱色，探究二者的最佳固定条件，为印染废水的处理提供参考。

1 材料与方法

菌种及试剂：含有CotA漆酶基因的毕赤酵母(Pichiapastoris)LS02-CotA，其CotA漆酶基因来源于凉水国家自然保护区的土壤中分离出的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WD23菌株。2-2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(简称ABTS)为Sigma公司产品，溴麝香草酚蓝为北京市旭东化工厂产品，CaCl2和海藻酸钠为国药集团化学试剂有限公司产品，其他常规试剂均为分析纯。培养基的配制参照文献[15]。

异源表达CotA漆酶的制备：参照文献[16]的方法制备芽孢粗酶液，CotA漆酶由毕赤酵母LS02-CotA分泌表达到培养基中，通过制备菌株的悬液得到具有漆酶活性的粗酶液。然后，按照参照文献[17]的方法测定漆酶酶活，1个漆酶活力(U)定义为，在1 min内氧化1 μmol底物所需要的酶量。ABTS的消光系数为36 000 L·mol-1·cm-1。

固定化CotA漆酶的制备：将15 mL质量分数为6%的海藻酸钠溶液与酶活性浓度为1 800 U/L的CotA漆酶液充分混合均匀后，用注射器缓慢地将混合液体均匀的滴入质量分数为2%的CaCl2溶液中，同时利用磁力搅拌器进行搅拌，立即有凝胶状小球生成；搅拌30 min，然后将小球滤出，用质量分数为0.2%的氯化钠溶液洗涤3次，再用蒸馏水冲洗2次，用吸水纸吸干表面水分，称质量[17-18]。固定化CotA漆酶的酶活力测定方法参照文献[19]，利用漆酶固定化前后的酶活力变化计算固定化效率。

CotA漆酶固定化的单因素试验：选用海藻酸钠质量分数为0.5%～3.0%、CaCl2溶液质量分数为1%～5%、CotA漆酶的酶活性浓度为100～400 U/L、固定化时间15～90 min，进行单因素试验，研究各因素对CotA漆酶固定化后相对酶活力的影响。以上操作均重复3次，取平均值。

在单因素试验基础上，采用L9(34)正交表，以海藻酸钠(A)、CaCl2(B)、CotA漆酶(C)、固定化时间(D)作为4个考察因素，选取3个水平进行试验(见表1)。

表1 CotA漆酶固定化正交试验的因素和水平

脱色体系的pH对溴麝香草酚蓝溶液脱色试验：配制pH=6.4～8.8的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，游离的CotA漆酶和固定化CotA漆酶的酶活性浓度均为200 U/L，BTB(用乙醇溶解)溶液的终质量浓度为50 mg/L，脱色体系为10 mL，设不加CotA漆酶的空白对照。脱色反应体系置于50 ℃的电热恒温水浴锅箱中脱色30 min，在618 nm处测定吸光值，计算染料脱色率；脱色率=(A0-A)/A0，A0为染料的初始吸光度，A为染料被漆酶脱色后的吸光度。重复3次取平均值。

CotA漆酶酶活性浓度对溴麝香草酚蓝溶液脱色试验：CotA漆酶酶活性浓度为50～350 U/L，游离CotA漆酶的脱色pH为7.6，固定化CotA漆酶的脱色pH为8.0，BTB(用乙醇溶解)溶液的终质量浓度为50 mg/L，脱色体系为10 mL，设不加CotA漆酶的空白对照。脱色反应体系置于50 ℃的电热恒温水浴锅箱中脱色30 min，在618 nm处测定吸光值，计算染料脱色率。重复3次取平均值。

温度对溴麝香草酚蓝溶液脱色试验：反应体系分别放在40～90 ℃的电热恒温水浴锅中进行脱色，游离的CotA漆酶和固定化CotA漆酶的酶活性浓度均为300 U/L。游离CotA漆酶的脱色pH为7.6，固定化CotA漆酶的脱色pH为8.0，BTB(用乙醇溶解)溶液的终质量浓度为50 mg/L，脱色体系为10 mL，设不加CotA漆酶的空白对照。脱色30 min，在618 nm处测定吸光值，计算染料脱色率。重复3次取平均值。

时间对溴麝香草酚蓝溶液脱色试验：游离CotA漆酶的脱色温度为60 ℃，固定化CotA漆酶的脱色温度为70 ℃，游离CotA漆酶的脱色pH为7.6，固定化CotA漆酶的脱色pH为8.0，游离的CotA漆酶和固定化CotA漆酶的酶活性浓度均为300 U/L，BTB(用乙醇溶解)溶液的终质量浓度为50 mg/L，脱色体系为10 mL，设不加CotA漆酶的空白对照。脱色4 h，每0.5 h取样在618 nm处测定吸光值，计算染料脱色率。重复3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 CotA漆酶固定化效率

用于固定化的CotA漆酶的酶活性浓度为1 800 U/L，固定化后CotA漆酶的酶活性浓度为580.2 U/L，因此，用常规的固定化方法计算，CotA漆酶固定化的效率为32.2%。

2.2 固定化参数对CotA漆酶活力的影响

2.2.1 单因素试验分析

在CaCl2溶液质量分数2%、固定化时间30 min、CotA漆酶的酶活性浓度300 U/L的条件下，不同海藻酸钠的质量分数对CotA漆酶固定化后相对酶活力的影响见图1A。海藻酸钠的质量分数在1.5%～2.5%范围内，固定化CotA漆酶的相对酶活力较高；海藻酸钠质量分数在2%时，CotA漆酶的相对酶活力达到最大值。海藻酸钠的质量分数过低，制备的固定化酶的机械强度差，固定效果不佳，在洗涤固定化酶时的损失比较大；海藻酸钠的质量分数过高，溶液黏度变大，影响酶与底物的充分结合[20]。

在海藻酸钠质量分数2%、固定化时间30 min、CotA漆酶的酶活性浓度300 U/L的条件下，不同CaCl2质量分数对CotA漆酶固定化后相对酶活力的影响见图1B。CaCl2质量分数在2%～4%范围内，固定化CotA漆酶的相对酶活力较高；CaCl2质量分数在3%时，固定化CotA漆酶的相对酶活力达最大值。CaCl2的质量分数过低，致使固定化酶的强度减弱，形成的凝胶网状孔径比较大，截留住的酶比较少，使得载体内部包埋的酶外流；CaCl2的质量分数过高，海藻酸钠与Ca2+形成的凝胶表面会布满Ca2+，使网状孔径过小，在酶促反应时，底物扩散阻力增加，降低了固定化酶的活性[21]。

图1 不同条件时固定化CotA漆酶的相对酶活力

在海藻酸钠质量分数2%、CaCl2溶液质量分数2%、固定化时间30 min的条件下，不同游离CotA漆酶酶活性浓度对CotA漆酶固定化后相对酶活力的影响见图1C。游离CotA漆酶酶活性浓度在250～350 U/L范围内，固定化CotA漆酶的相对酶活力较高；游离CotA漆酶酶活性浓度在300 U/L时，固定化CotA漆酶的相对酶活力达最大值。当游离CotA漆酶酶活性浓度较低时，大部分酶能够吸附到海藻酸钙凝胶上，但是由于达不到饱和而使固定化CotA漆酶活力不高；当游离CotA漆酶酶活性浓度超过300 U/L之后，固定化CotA漆酶活力开始降低，这是由于过量的酶在达到饱和后与载体发生反应或是改变了酶的活性中心，从而降低了固定化酶的活性[22]。

在海藻酸钠质量分数2%、CaCl2溶液质量分数2%、CotA漆酶的酶活性浓度300 U/L的条件下，不同固定化时间对CotA漆酶固定化后相对酶活力的影响见图1D。固定化时间在30～60 min内，固定化CotA漆酶的相对酶活力较高；固定时间在45 min时，固定化CotA漆酶的相对酶活力达最大值。固定化时间过短，CotA漆酶没有被牢固地固定在小球内，用蒸馏水清洗时会泄露；固定化时间过长，海藻酸钙交联程度高，结构较致密，底物扩散阻力增加，导致CotA漆酶活性降低[23]。

2.2.2 正交试验分析

正交试验1～9组试验中，固定化CotA漆酶酶活性浓度分别为52.9、125.8、63.7、111.0、61.3、79.6、100.8、63.7、72.1 U/L。由表2可见：各因素对CotA漆酶固定化后，对固定化CotA漆酶酶活性浓度影响程度从大到小的因素，依次为：固定化时间、CotA漆酶酶活性浓度、CaCl2质量分数、海藻酸钠质量分数，最适固定化条件为海藻酸钠质量分数1.5%、CaCl2质量分数3%、CotA漆酶酶活性浓度300 U/L、固定化时间45 min，在此条件下固定化CotA漆酶的酶活性浓度达125.8 U/L、固定化效率为41.9%，比优化前的固定化效率提高了30.1%。

表2 CotA漆酶固定化正交试验酶活性浓度的极差分析

U·L-1

2.3 不同CotA漆酶对溴麝香草酚蓝脱色率的影响

游离CotA漆酶在pH为7.6时，对BTB脱色率最高，为67.12%；固定化CotA漆酶在pH为8.0时，脱色率最高，为76.81%(见图2A)。在碱性较高的条件下，固定化CotA漆酶比游离CotA漆酶对染料脱色的效果好，是游离CotA漆酶直接与碱性溶液接触，破坏了酶的结构致，使酶活力降低；而固定化漆酶，由于包埋在海藻酸钙中，在一定程度上受到了保护。游离与固定化CotA漆酶对BTB的脱色率，均在CotA漆酶酶活性浓度为300U/L时，达到最大值(见图2B)。游离和固定化CotA漆酶的最适脱色温度分别为60、70 ℃；在70～90 ℃条件下，固定化CotA漆酶对BTB的脱色率较高(见图2C)，表明固定化漆酶的热稳定性更好。脱色3 h内，游离CotA漆酶对BTB的脱色效果稍好；3 h后，固定化CotA漆酶脱色率较高(见图2D)。

3 结论与讨论

本研究毕赤酵母菌表达的固定化CotA漆酶，在pH为8.0时，对溴麝香草酚蓝脱色率最高；高千千等[24]报道，固定化白毒鹅膏真菌漆酶对分散蓝-2BLN的脱色，在pH为4.12～5.16之间脱色效果最好；李凡姝等[25]研究了芽孢杆菌菌株CLb的芽孢漆酶对活性黑和靛红的脱色，pH为7.0时脱色效果最好；可见，毕赤酵母表达的CotA漆酶更具耐碱性。本研究的CotA漆酶，在60～70 ℃下仍能保持较高脱色活性；韩启灿等[26]报道了落叶松附毛孔真菌漆酶，对孔雀石绿在40 ℃时的脱色效果最好；郑文爽[22]研究了固定化疣孢漆斑菌胞外漆酶对偶氮类染料的脱色，在35～55 ℃时对染料的脱色效果好；可见，毕赤酵母表达的CotA漆酶在高温下仍具有高活性。

本研究确定了CotA漆酶固定化过程中，各影响因素对漆酶活力的影响强度，并优化了CotA漆酶的固定化条件，固定化效率比优化前提高了23%。固定化CotA漆酶，在70 ℃、pH为8.0时，对溴麝香草酚蓝溶液的脱色率最高；而游离的CotA漆酶，在60 ℃、pH为7.6时，对溴麝香草酚蓝溶液的脱色率最高；表明，固定化CotA漆酶比游离CotA漆酶更耐高温和高pH。试验结果可为高温和高碱的印染废水处理提供参考。

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ImmobilizationofCotALaccaseandDecoloringBromothymolBlue

//Xing Dan, Ma Minghong, Wu Hangshen, Sun Haiqiong, Wang Jueyu, Wang Chunlei, Zhao Min

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)

CotA laccase gene from Bacillus subtilis isolated from forest soil was expressed in Pichia pastoris. The immobilization efficiency of CotA laccase expressed fromPichiapastoriswas 32.2% with calcium alginate as carrier. The immobilization efficiency was increased by 30.1% through optimizing immobilization condition under orthogonal experiment. The highest decolorization rate of bromothymol blue by immobilized CotA laccase was 76.81% under 30 min, 70 ℃ and pH of 8.0. The highest decolorization rate of bromothymol blue by free laccase was 67.12% under 30 min, 60 ℃ and pH of 7.6. The results indicated that immobilized CotA laccase had higher enzyme activity than free CotA laccase under heat and alkali condition.

CotA laccase; Bromothymol blue; Dyes decolorizing

Q554；TQ61

1)国家林业局“948”项目(2012-4-03)；国家自然科学基金项目(51678120)；黑龙江省博士后资助经费(LBH-Z11254)。

邢丹，女，1990年1月生，东北林业大学生命科学学院，硕士研究生。E-mail：1803866001@qq.com。

汪春蕾，东北林业大学生命科学学院，副教授。E-mail：wcls-1972@163.com。赵敏，东北林业大学生命科学学院，教授。E-mail：82191513@163.com。

2017年4月21日。

责任编辑：张 玉。

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(10)：40-43,48.