丁香等29种植物提取物抑菌活性的筛选1)

姚翰文 葛康康 潘佳亮 刘伟璐 马玲

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

丁香等29种植物提取物抑菌活性的筛选1)

姚翰文 葛康康 潘佳亮 刘伟璐 马玲

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

采用生长速率法测定了29种植物乙醇提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病的抑制作用，筛选出抑菌效果较好的植物提取物，并对2种病原菌进行室内毒力测定，得出抑菌效果最优的植物提取物，使用光学显微镜观察植物提取物处理后的油茶炭疽病菌菌丝形态变化。结果显示，质量浓度为20 g/L时，丁香和牡丹提取物对2种病原菌抑制效果明显高于其他植物提取物，丁香提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病的抑菌率均为100%，牡丹提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病的抑菌率分别为(93.81±0.51)%和100%；室内毒力试验中，丁香和牡丹提取物对山核桃干腐病的抑菌中浓度值(CE50)分别为2.566和10.268 g/L，对油茶炭疽病的CE50值分别为1.005和10.988 g/L，由它们的抑菌中浓度值可知，相同质量浓度时，丁香对2种病原菌抑菌效果更好；显微镜观察发现，丁香提取物处理后油茶炭疽病菌菌丝出现菌丝隔的数目增多，细胞内原生质体减少，液泡增多等形态变化。

植物源农药；植物提取物；丁香；山核桃干腐病；油茶炭疽病；抑菌活性；室内毒力

在人类的生产生活中，自古就有利用植物源物质作为农药的历史[1]。长期持续使用化学农药，会对环境和生物产生危害，而且由于耐药性的产生效果逐渐减弱，农药的残留也给生态环境带来许多负面影响。由于农药的风险和危害，法律政策的限制也越来越严格[2]。因此，植物源农药作为一种具有选择性高、对非靶标生物安全、低毒环保、绿色健康、易于降解、不易产生抗性、促进提高抗病性等优点的新型农药，逐渐为人们重视和青睐，成为了农药领域的“新宠”[3-5]。

植物体内有超过40万种的活性成分，如生物碱类、酚类、黄酮类、糖苷类、蛋白质类、有机酸类、醌类、甾类、菇烯类及植物挥发油等，这些化合物的靶标具有广谱性，其中许多具有杀虫或抑菌活性。据报道，约有2 400种植物可作为植物源农药的研究材料，其中有超过1 300种植物具有抑菌活性，从丰富的植物资源中筛选开发更优的抑菌植物成为植物源农药领域的主要发展趋势[6]。

山核桃干腐病是由以弱寄生菌(Botryosphaeriadothidea)为代表的葡萄座腔菌属的真菌引起的一种重要病害，在山核桃大面积栽植中会造成枯枝枯树、削弱树势等现象，从而降低山核桃的产量，对山核桃的栽培威胁很大，目前对于山核桃干腐病的防治主要依靠化学杀菌剂，如爱苗乳油、402抗菌剂乳油、乙蒜素乳油和硫酸铜晶体等[7-8]。油茶炭疽病的主要病原菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，会引起油茶的落花、落果、枯枝等，在油茶种植地区危害很大，是油茶的主要病害之一[9-10]。目前油茶炭疽病的防治主要采用化学药剂防治，如多菌灵、波尔多液和茶枯水等[11]。有研究报道，扑菌清、叶斑净、宝宁、百菌清、百菌通和甲基托布津等化学药剂也可有效防治油茶炭疽病[12-13]。这2种真菌病害在我国林业生产中造成巨大的经济损失，对它们的防治方法均以化学农药为主，使用植物源农药进行生物防治的技术仍处于起步阶段。

本研究根据查阅相关文献筛选出29种抑菌植物作为试验对象，使用植物乙醇提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病2种病原菌进行抑菌活性筛选，旨在发现抑菌效果较好的抑菌植物，为新型植物源农药的研发提供一定的线索及理论依据。

1 材料与方法

试验所用植物样品详见表1。表1中植物样品均采购于中药店，置于烘箱中60 ℃烘干，粉碎，过40目(孔径0.37 mm)筛，装袋标记，冰箱4 ℃低温保存，备用[14]。

供试病原真菌为山核桃干腐病病原菌(Botryosphaeriadothidea)和油茶炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)，均由东北林业大学森林保护学科实验室提供。

无水乙醇为市售分析纯。

1.1 植物提取物的制备

取每种植物材料10 g于500 mL锥形瓶中，每瓶加入200 mL预先配制好的90%乙醇溶液，超声波提取60 min，避光静置，减压抽滤收集所得滤液，将剩余植物残渣再按照上述操作重复提取2次，合并3次超声提取所得滤液，使用旋转蒸发仪40 ℃条件下旋转蒸干，用10%乙醇溶液溶解旋干物，并定容至20 mL，此时干物质质量浓度为0.05 g/L，置于冰箱4 ℃保存备用[15]。

1.2 植物提取物的提取率测定

将上述所得干物质质量浓度为0.05 g/L的植物提取物，各取出500 μL置于预先测定质量的葡萄糖瓶中，将小瓶置于冰箱中-80 ℃冷冻，再用冷冻干燥仪将瓶中溶液干燥至恒质量，取出各瓶，再次测量各葡萄糖瓶质量，计算每个葡萄糖瓶前后的质量差即为500 μL提取液中提取物的质量，从而得到每种植物样品的提取率。

1.3 抑菌活性筛选测定

采用菌丝的生长速率法[16]测定29种供试植物乙醇提取物对两种病原菌菌丝生长的抑制活性：在无菌的超净工作台中，使用移液器取植物提物液2 mL，加入到48 mL已经融化好的PDA培养基中，摇晃均匀，制成质量浓度为20 g/L的带药培养基，将带药培养基趁热倒入直径为8.5 cm的培养皿中，每个培养皿中倒入15 mL，制备带药平板，自然冷却，使用直径为0.6 cm打孔器在供试病原菌平板的菌落边缘制备菌饼，用接种针将菌饼菌丝面朝下放入带药平板中央，封好后置于25 ℃培养箱中培养，每种处理组3个重复。待对照组菌丝生长到培养皿底部2/3时测量数据。阴性对照组是将等量溶剂加入至48 mL融化的PDA培养基中，阳性对照组为等量无菌水加入至48 mL融化的PDA培养基中，制备平板，接菌。采用十字交叉法测量菌落直径，使用SPSS数据分析软件处理得到抑菌率。

抑菌率=((阴性对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(阴性对照组菌落直径-菌饼直径))×100%

1.4丁香和牡丹提取物对两种病原菌的室内毒力测定

将不同量的丁香提取液和牡丹提取液加入PDA培养基中制成系列质量浓度梯度的带药平板，接种病原菌菌饼，培养。阴性对照组为加入对应等量溶剂的平板，质量浓度分别对应各带药平板质量浓度。十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，使用SPSS数据分析软件得到两种植物提取物分别对2种病原菌的毒力回归方程和CE50值[17]。

1.5丁香提取物处理后对油茶炭疽病菌丝显微镜观察

根据丁香植物提取物对2种病原真菌的CE50值，由于油茶炭疽病的CE50值较小，以油茶炭疽病为例，将丁香提取液制成质量浓度为CE50值的带药平板，对照组为加入等量溶剂的PDA平板，接菌培养。将菌丝固定制成临时玻片，在光学显微镜下观察菌丝形态变化。

2 结果与分析

2.1供试植物提取物对两种病原菌菌丝的抑制作用

采用生长速率法测定了29种植物提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病两种林业病害真菌的抑制作用(表1)。结果表明，在质量浓度为20 g/L时，各供试植物提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病均有一定的抑制作用。其中，丁香、牡丹、甘草、黄芩、羌活、升麻、川芎、桑和黄连等9种植物提取物对山核桃干腐病有较好的抑制作用，抑菌率均在60%以上。丁香提取物对山核桃干腐病病原菌的抑菌率达到100%，提取率为27.41%；牡丹提取物抑菌率为(93.81±0.51)%，提取率为20.24%，这两种植物提取物对山核桃干腐病病原菌有着明显优于其他供试植物提取物的抑菌效果。此外，甘草和黄芩两种植物提取物对山核桃干腐病抑菌效果也较好，分别为(82.91±1.35)%和(80.46±0.21)%；八角、决明、薄荷、肉桂和苍耳等5种植物提取物抑菌效果较差，均低于20%，肉桂和苍耳提取物的抑菌率仅为(9.24±3.58)%和(2.17±3.67)%。

对油茶炭疽病病原菌的抑制效果中，丁香、牡丹、黄连、石榴皮、黄芩、八角、藿香、知母、苦参和升麻等10种植物提取物抑菌效果较好，抑菌率均在60%以上。丁香和牡丹两种植物提取物的抑菌率都高达100%，黄连和石榴皮抑菌率分别为(96.67±0.21)%和(92.31±2.23)%，黄芩提取物的抑菌率也可达(80.13±1.77)%，白头翁和芦苇的抑菌效果较差，分别为(19.37±1.35)%和(9.92±3.69)%。综合两种病原菌抑菌率结果，可以得出丁香和牡丹提取物对两种病原真菌的抑菌效果均明显优于其他供试植物，黄芩、黄连和升麻的抑菌效果也相对较好。

表1 不同植物提取物对2种病原菌的抑制作用及提取率 %

注：表中数据平均值±标准差；同列不同小写字母表示不同植物提取物处理组之间在0.05水平存在显著差异(n=3)。

2.2 丁香和牡丹提取物对两种病原菌的室内毒力

丁香和牡丹提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病两种病原菌的毒力回归方程和CE50值见表2。对山核桃干腐病病原菌的室内毒力结果显示，丁香和牡丹的CE50值分别为2.566和10.268 g/L，丁香的CE50值低于牡丹，所以相同质量浓度条件下，丁香提取物比牡丹提取物抑菌毒力强。同样的，对于油茶炭疽病病原菌的室内毒力结果显示，丁香CE50值1.005 g/L，低于牡丹CE50值10.988 g/L，相同质量浓度条件下，丁香提取物抑菌效果也比牡丹提取物好。综合两种病原真菌室内毒力测定结果，丁香比牡丹抑菌效果更好，更有潜力开发为植物源杀菌剂(图1)。

表2丁香和牡丹两种植物提取物对两种病原菌的室内毒力测定

病原真菌植物提取物毒力回归方程CE50值/g·L-1相关系数山核桃干腐病丁香y=-1.627+0.634x2.5660.980山核桃干腐病牡丹y=-1.317+0.128x10.2680.982油茶炭疽病丁香y=-0.970+0.965x1.0050.973油茶炭疽病牡丹y=-0.509+0.46x10.9880.971

2.3 丁香提取物处理后油茶炭疽病菌丝形态变化

抑菌中浓度(CE50)条件下，丁香提取物对油茶炭疽病病原菌菌丝的影响见图2。由图2对比显示，相比于油茶炭疽病的正常菌丝形态，经丁香提取物处理后，菌丝形态发生变化，呈现菌丝隔的数目增多，细胞内原生质体减少，液泡增多等。由此推断丁香提取物对油茶炭疽病的抑菌效果会在病原菌菌丝形态变化上有所体现，但具体更深层次的观察包括扫描电镜，透射电镜等，会在后续试验中进行，并验证。

①为丁香提取物处理山核桃干腐病；②为牡丹提取物处理山核桃干腐病；③为丁香提取物处理油茶炭疽病；④为牡丹提取物处理油茶炭疽病；A—E为提取物质量浓度从高到低顺序，CK为对照组。

图1不同质量浓度丁香和丹皮提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病的病原菌菌丝抑制效果

①为正常形态菌丝形态；②为处理后菌丝形态。

3 结论与讨论

试验测定了29种植物提取物对山核桃干腐病和油茶炭疽病这两种病原菌的抑制作用，发现丁香和牡丹2种提取物对两种病原菌的抑制效果明显高于其他供试植物提取物，使用丁香和牡丹提取物对2种病原真菌进行室内毒力测定，结果表明相同质量浓度时，丁香提取物抑菌效果优于牡丹提取物，认为本研究的29种植物提取物抑菌初筛中最优的植物提取物为丁香提取物。通过光学显微镜观察丁香处理后油茶炭疽病菌丝形态，呈现菌丝隔的数目增多，细胞内原生质体减少，液泡增多等变化，推测其抑菌作用在菌丝形态上有所体现，更深入的研究，如扫描电镜、透射电镜等，会在后续实验中进行验证。

本研究结果表明，丁香提取物和牡丹提取物对山核桃干腐病菌和油茶炭疽病菌均有较好的抑制作用，且这两种植物提取物的提取率也较高，其中丁香提取物对两种病原菌的毒力更强。郭新春等[18]研究发现，公丁香对棉花枯萎病、杨树溃疡病、油菜菌核病和小麦赤霉病这4种病原菌均有很高的抑制作用，结合本研究结果，丁香植物提取物具有一定的抑菌广谱性。周建宏等[19]研究表明，丁香枝和黄芩茎的水提取物对油茶炭疽病和油茶软腐病均有较强抑制效果，这与本研究结果相符合，但抑菌率低于本研究抑菌率。对山核桃干腐病防治的研究多集中在化学农药方面，张传清等[20]研究测定了7种化学杀菌剂对山核桃干腐病的抑制活性，结果由高到低依次为苯醚甲环唑、戊唑醇、腐霉利、甲基硫菌灵、百菌清、醚菌酯、啶酰菌胺，利用植物源农药防治山核桃干腐病的报道较少。

本研究对29种植物乙醇提取物的抑菌效果测定会存在一定的漏筛现象，可能是以下几个原因：①供试植物样品在60 ℃条件下烘干，可能导致植物中某些有效抑菌成分因挥发而遗失，或发生破坏。②由于供试植物样品为市售中药材，研究中只使用了植物的药用部位，而不是整株植物，故会出现供试部位的漏筛。③由于考虑操作方便性，成本节约等，筛选试验中，只使用90%乙醇溶液这一种溶剂作为提取溶剂，且只用20 g/L这一个质量浓度，可能导致部分有效抑菌物质不能提取出来，或活性成分较少，在本供试质量浓度下不能表现出较强的抑菌活性。④本研究针对两种病原真菌进行了测定，不能筛选出供试植物样品中对其他病原真菌有较好抑制活性的植物，从而出现某种植物的漏筛。⑤本研究只是测定了植物提取物对两种病原真菌菌丝生长的抑制作用，而未进行对孢子萌发的测定和活体试验以及田间试验。

本研究筛选出了对山核桃干腐病和油茶炭疽病均有较好抑菌作用的植物提取物，虽只针对其中抑菌效果最优的丁香提取物做了更深入的研究，但其他植物，例如牡丹，黄芩，黄连，升麻等，仍然也有深入研究并发展为有效植物源农药的潜力。本研究为山核桃和油茶的真菌病害防治提供了一定的线索，同时发掘了可能具有广谱抑菌效果的丁香提取物，为丁香提取物抑菌的研究提供了理论依据。对丁香提取物主要抑菌活性成分以及其抑菌机理有待进一步研究。

[1] 张兴，马志卿，冯俊涛，等.植物源农药研究进展[J].中国生物防治学报，2015,31(5):685-698.

[2] CASIDA J E. Pest toxicology: the primary mechanisms of pesticide action.[J]. Hayes Handbook of Pesticide Toxicology,2010,22(4):103-117.

[3] 张兴，吴志凤，李威，等.植物源农药研发与应用新进展——特殊生物活性简介[J].农药科学与管理，2013,34(4):24-31.

[4] YOON M Y, CHA B, KIM J C. Recent trends in studies on botanical fungicides in agriculture[J]. Plant Pathology Journal,2013,29(1):1-9.

[5] 何军，马志卿，张兴.植物源农药概述[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2006,34(9):79-85.

[6] 单承莺，马世宏，张卫明.我国植物源农药研究进展[J].中国野生植物资源，2011,30(6):14-18.

[7] 杨淑贞，丁立忠，楼君芳，等.山核桃干腐病发生发展规律及防治技术[J].浙江农林大学学报，2009,26(2):228-232.

[8] 周军，丁立忠，张慧.山核桃干腐病综合防治技术[J].浙江林业，2016(4):30-31.

[9] 刘伟.油茶炭疽病的病原学、发病规律及防治技术研究[D].武汉：华中农业大学,2012.

[10] 靳爱仙，周国英，李河.油茶炭疽病的研究现状、问题与方向[J].中国森林病虫，2009,28(2):27-31.

[11] 姜晓装.油茶病虫害的防治措施[J].林业工程学报，2001,15(5):35-37.

[12] 陈绍红，孙思，王军.14种杀菌剂对油茶炭疽病的防治研究[J].广东林业科技，2007,23(2):42-45.

[13] 黄新华.百菌清等3种药剂防治油茶炭疽病药效试验[J].江西林业科技，2000(2):18-19.

[14] 冯俊涛，石勇强，张兴.56种植物抑菌活性筛选试验[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2001,29(2):65-68.

[15] 孙伟.101种植物提取物对两种植物病原菌生物活性的研究[D].北京：中国农业科学院,2011.

[16] 吴文君.植物化学保护实验技术导论[M].西安：陕西科学技术出版社,1988.

[17] 李广领，陈军，陈锡岭，等.几种杀菌剂对玉米新月弯孢霉室内毒力测定[J].现代农业科技，2006(2s):21-22.

[18] 郭新春.38种中药提取物对4种植物病原菌抑制活性的初步研究[D].长春：东北师范大学,2006.

[19] 周建宏，刘君昂，邓小军，等.植物提取物对油茶主要病害的抑菌作用[J].中南林业科技大学学报，2011,31(4):42-45.

[20] 张传清，章祖平，孙品雷，等.山核桃干腐病菌对7种杀菌剂的敏感性比较及其对苯醚甲环唑敏感基线的建立[J].农药学学报，2011,13(1):84-86.

ScreeningAntifungalActivityof29PlantExtractsincludingSyzygiumaromaticum

//Yao Hanwen, Ge Kangkang, Pan Jialiang, Liu Weilu, Ma Ling

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)

The inhibitory effects of ethanol extracts of 29 plants onBotryosphaeriadothideaandColletotrichumgloeosporioideswere determined by the growth rate method. Two plant extracts with good antifungal effect were screened out and the laboratory toxicity of the two pathogens was tested to find out the better plant extract. After using the plant extract, the hyphae morphological changes ofC.gloeosporioideswere observed by optical microscopy. The inhibitory effects ofSyzygiumaromaticumextract andPaeoniasuffruticosaextract on the two pathogens were higher than that of other plant extracts at the concentration of 20 g/L. The inhibitory rates ofS.aromaticumextract on the two pathogens were both 100%, and the inhibitory rates ofPaeoniasuffruticosaextract onB.dothideaandC.gloeosporioideswere, respectively, (93.81±0.51)% and 100%. In the study of laboratory toxicity, theCE50of the extracts ofSyzygiumaromaticumandP.suffruticosaonB.dothideawere 2.566 and 10.268 g/L, and onC.gloeosporioideswere 1.005 and 10.988 g/L, respectively. Compared with the values ofCE50, at the same content, the inhibitory effect ofS.aromaticumextract on the two pathogens was better. By microscopic observation, there were changes in the morphology of hyphae ofC.gloeosporioides, involving the increased number of the septum of hyphae, the reduction of intracellular protoplast, and the increased vacuoles.

Botanical pesticides； Plant extracts；Syzygiumaromaticum；Botryosphaeriadothidea；Colletotrichumgloeosporioides； Antifungal activity； Laboratory toxicity

S482.2+92

1)林业公益行业专项(No.201304403-4)。

姚翰文，男，1993年8月生，东北林业大学林学院，硕士研究生。E-mail：1040361540@qq.com。

马玲，东北林业大学林学院，教授。E-mail：Maling63@163.com。

2017年4月19日。

责任编辑：潘 华。

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(10)：35-39.