可溶性泛素样特异性蛋白酶1的表达及活性鉴定

冯丽丽，陈海燕，刘毓侠，郭彦，周国利，任银玲

1.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002；2.聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252059

可溶性泛素样特异性蛋白酶1的表达及活性鉴定

冯丽丽1，陈海燕1，刘毓侠1，郭彦2，周国利2，任银玲1

1.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002；2.聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252059

目的：高效可溶性表达泛素样特异性蛋白酶1（ULP1）。方法：根据大肠杆菌密码子的偏好性优化合成编码ULP1的基因片段序列，将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导表达8 h，观察重组蛋白ULP1的表达情况；优化诱导时间及IPTG浓度，并鉴定重组蛋白ULP1的生物学活性。结果：重组蛋白ULP1表达的最佳条件为37℃、0.1 mmol/L的IPTG诱导表达5 h，目的蛋白以可溶性表达为主；Western印迹结果表明，重组蛋白ULP1能够被His单克隆抗体识别，重组蛋白ULP1能够特异性酶切SUMO-GFP。结论：表达了具有生物学活性的SUMO蛋白酶ULP1。

泛素样特异性蛋白酶1（ULP1）；SUMO蛋白酶；表达；纯化；生物学活性

泛素样特异性蛋白酶（ubiquitin-like specific protease，ULP）为半胱氨酸蛋白酶超家族成员，在真核生物体内可将小分子泛素样修饰物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）底物蛋白偶合物水解成SUMO和底物，此过程称为去SUMO化（de⁃sumoylation）[1-4]。酿酒酵母中含有2种SUMO蛋白酶，即ULP1和ULP2。ULP1位于核孔复合体中，ULP2则主要位于细胞核内。目前对ULP1的研究较多。ULP1由621个氨基酸残基组成，至少含有2个结构域，C端蛋白酶折叠区域（432～621 aa）保守性高，N端结构域（1～432 aa）保守性弱，其中第403～621 aa片段具有全长ULP1的酶切活性，且可水解以α氨基连接的SUMO蛋白[5-6]。

SUMO蛋白广泛存在于真核细胞中，具有重要的生物学功能，参与多种生命过程[7]。SUMO标签能显著增加重组蛋白的表达量、促进靶蛋白的正确折叠及防止蛋白酶水解，被广泛应用于重组蛋白表达的融合标签[8]。利用SUMO表达系统体外表达重组蛋白，须以SUMO蛋白酶为切割工具分离靶蛋白[9-10]。ULP1能够识别含SUMO标签蛋白的蛋白质序列，且可高效地将SUMO标签蛋白与融合蛋白切割开。ULP1的酶切反应特异性高，可在较宽范围的反应体系中保持较高的活力，如pH值（5.5～9.5）、温度（4～30℃）等。因此，表达活力高和特异性强的SUMO蛋白酶具有十分重要的经济价值。在本研究中，我们根据GenBank公布的ULP1（Q02724）氨基酸序列，结合大肠杆菌密码子偏好性优化合成ULP1基因序列，并设计相应的表达引物，PCR扩增编码ULP1第403～621 aa活性片段的基因序列，将其克隆到原核表达载体中，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，以期表达出高活力和高特异性的重组ULP1，为带SU⁃MO标签融合蛋白的高效纯化奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌BL21（DE3）及JM109感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司；pGEX-6P-1表达载体购自Amersham公司。根据大肠杆菌密码子偏好性优化编码ULP1的基因片段，由生工生物（上海）股份有限公司合成。

His标签单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG购自Abcam公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ及T4DNA连接酶购自Promega公司；IPTG诱导剂购自INALCO公司；质粒提取试剂盒购自Omega公司；蛋白质marker、DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；AEC显色试剂盒购自中杉金桥公司；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2 ULP1基因及表达引物的设计与合成

根据GenBank公布的ULP1蛋白序列（Q02724），按照大肠杆菌密码子偏好性优化ULP1基因序列，并设计表达引物ULP1-F（5'-TG GGATCCATGCTTGTTCCTGAATTAAA-3'，下 划 线部分为BamHⅠ酶切位点）和ULP1-R（5'-AATCT CGAGTTAGTGATGATGATGATGATG-3'，下划线部分为XhoⅠ酶切位点）。ULP1基因片段及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 重组表达载体构建

应用引物ULP1-F/R，以合成的ULP1基因片段为模板进行PCR扩增，获得ULP1基因片段；用BamHⅠ、XhoⅠ分别双酶切目的基因片段和pGEX-6P-1载体，用T4DNA连接酶按3∶1的比例连接，转化大肠杆菌JM109，经菌液PCR鉴定，对阳性结果的质粒进行测序，将测序正确的阳性菌株命名为pGEX-ULP1；将提取的阳性菌株质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），用于重组蛋白表达。

1.4 重组蛋白ULP1的表达与可溶性分析

将pGEX-ULP1菌液按1∶1000的比例接种至5 mL含50 μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中，过夜37℃培养；按1∶100的比例接种到50 mL LB培养基中，培养至D450nm约为0.6时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，诱导培养8 h；收集细菌培养液，4℃、12 000 r/min离心10 min后弃上清，向沉淀中加入2 mL PBS缓冲液，将重悬的菌体进行超声波破碎，4℃、12 000 r/min离心10 min，SDSPAGE检测；在15 V、1 h条件下，用电转仪将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜（NC膜），用5%的脱脂奶于4℃封闭过夜，以His单克隆抗体（1∶5000稀释）为一抗孵育60 min，以HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶5000稀释）为二抗孵育30 min，AEC显色，观察目的蛋白的表达。

1.5 重组蛋白ULP1的表达条件优化

分别对IPTG诱导浓度、诱导时间进行优化。在IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为37℃条件下，诱导时间分别选择 2、4、5、6、7、8、9 h；在温度37℃、诱导5 h条件下，分别选择0.1、0.3、0.6、0.9、1 mmol/L的IPTG浓度。将以上条件下的表达产物进行SDS-PAGE检测，以确定重组蛋白的最佳诱导条件。

1.6 重组蛋白ULP1的纯化

采用Ni亲和柱纯化，先用结合缓冲液（含10 mmol/L咪唑）平衡Ni亲和柱，将裂解液缓慢流过Ni亲和柱，用含20 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗涤Ni亲和柱，最后用含250 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱表达的目的蛋白。

1.7 重组蛋白ULP1的酶切活性鉴定

分别选用本研究纯化获得的ULP1及商品化的ULP1对SUMO-GFP蛋白进行酶切反应。商品化酶反应体系：40 μL SUMO-GFP融合蛋白，2 μL（10 U/μL）SUMO 蛋白酶，10 μL 10×SUMO 蛋白酶缓冲液，加ddH2O至总体积为80 μL；重组ULP1反应体系：40 μL SUMO-GFP融合蛋白，10 μL SUMO蛋白酶，8 μL 10×SUMO蛋白酶缓冲液，加ddH2O至总体积为80 μL。上述反应体系在30℃反应4 h，反应产物进行SDS-PAGE检测，以确定纯化后重组蛋白的酶切活性。

2 结果

2.1 ULP1基因的PCR扩增及pGEX-ULP1重组表达质粒的鉴定

用引物ULP1-F/R进行PCR扩增，在约700 bp处出现特异性条带，与预期ULP1基因片段大小一致（图1）；将扩增的ULP1基因片段克隆至pGEX-6P-1载体，菌液PCR鉴定结果显示为阳性（图2）；提取阳性菌株的质粒并进行双酶切鉴定，在约700 bp处有预期目的条带（图3）。将阳性质粒送样测序，结果表明重组表达质粒pGEX-ULP1构建成功。

图1 ULP1片段PCR扩增结果

图2 pGEX-ULP1菌液PCR鉴定结果

图3 pGEX-ULP1双酶切鉴定结果

2.2 重组蛋白ULP1的诱导表达及可溶性分析

超声波破碎处理的样品上清及沉淀分别进行SDS-PAGE及Western印迹鉴定，结果表明，在相对分子质量48 000处有特异的蛋白质条带，与预测的ULP1重组蛋白大小一致，目的蛋白大部分以可溶性形式存在，且能与抗His标签单克隆抗体特异性结合（图4）。

2.3 重组蛋白ULP1的表达条件优化

分别对诱导表达重组蛋白ULP1的诱导时间、IPTG浓度进行优化，结果发现，诱导5 h时表达量达到最高，故选择5 h作为最佳诱导表达时间（图5）。当IPTG浓度为0.1 mmol/L时，目的蛋白的表达量明显高于0.3 mmol/L；而IPTG浓度高于0.3 mmol/L时的表达变化不很明显，故选择0.1 mmol/L作为最佳IPTG诱导浓度（图6）。

图5 0.5 mol/L IPTG诱导不同时间的重组蛋白ULP1的表达

图6 不同IPTG浓度诱导5 h的重组蛋白ULP1的表达

2.4 重组蛋白ULP1的纯化

分别采用Ni-NTA亲和树脂及阳离子交换层析纯化目的蛋白。图7为Ni柱亲和层析纯化结果，重组蛋白与Ni柱结合良好，特异性强，经亲和纯化后目的蛋白纯度较高，可达95%。

图7 重组蛋白ULP1的Ni柱亲和层析纯化

2.5 重组蛋白ULP1的酶切活性鉴定

从图8可以看出，纯化的重组蛋白ULP1可将SUMO-GFP完全切开，出现相对分子质量分别约为26 000和18 000的2条带。可见，表达的重组蛋白ULP1具有SUMO蛋白酶活性。

图8 重组蛋白ULP1的活性鉴定

3 讨论

我们构建并高效表达了可溶性ULP1活性片段，利用重组蛋白ULP1的6×His标签进行Ni-NTA纯化后,其纯度达95%以上。重组蛋白ULP1与商品化SUMO蛋白酶对SUMO-GFP的切割结果一致，表明本研究表达的重组蛋白具有天然ULP1的酶切活性。

ULP1专一性强，识别蛋白质的三维结构，且其可从SUMO末端将目的蛋白切割下来，切割后不存在任何氨基酸残留。此外，SUMO融合标签分子较小，可促进蛋白可溶性表达、正确折叠，防止蛋白降解[11-13]。鉴于以上优点，SUMO表达系统被广泛应用，其切割酶ULP1的需求量也随之增加。但ULP1在正常真核细胞中的表达量非常低,故本研究按照大肠杆菌密码子的偏好性来优化合成SUMO蛋白酶活性片段ULP1基因,使得ULP1能够高水平表达，经纯化得到活性较强的SUMO蛋白酶ULP1。

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Souble Expression and Biological Activity Identification of Ubiquitin-Like Specific Protease 1

FENG Li-Li1,CHEN Hai-Yan1,LIU Yu-Xia1,GUO Yan2,ZHOU Guo-Li2,REN Yin-Ling1*
1.Institute of Agricultural Economics and Information,Henan Academy of Agriculture Sciences,Zhengzhou 450002;2.College of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng 252059;China

Obective:To obtain souble expressive ubiquitin-like specific protease 1（ULP1）.Methods:ULP1 gene was optimized according to the preference codon usage ofE.coli.ULP1 gene was synthesized and then cloned into pGEX-6P-1 vector,and transformed intoE.coliBL21（DE3） competent cells.Inducing time and con⁃centration of IPTG were optimized,and ULP1 was induced by 0.5 mmol/L IPTG at 37℃for 5 h.Results:The best inducing conditions of was in 0.1 mmol/L IPTG,and expressed as a souble fusion protein.The catalytic reac⁃tion of ULP1 to SUMO-GFP showed high specificity and activity.Conclusion:The souble fusion ULP1 with bio⁃logical activity was successful expressed.

ubiquitin-like specific protease 1（ULP1）;SUMO protease;expression;purification;biological activity

Q786

A

1009-0002（2017）05-0629-05

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:916797076@qq.com

2017-03-01

国家自然科学基金（31571274）；山东省自然科学基金（ZR2015CM025）；河南省农业科学院高层次人才科研启动项目

冯丽丽（1983- ），女，博士，助理研究员，（E-mail）707642217@qq.com

任银玲，（E-mail）916797076@qq.com