PCR-荧光探针法检测庆阳地区丙型肝炎病毒基因型①

侯娟娟 张志峰 张吉平 席维岳 郑红军 赵海燕 李 娟

(庆阳市人民医院检验科，庆阳 745000)

PCR-荧光探针法检测庆阳地区丙型肝炎病毒基因型①

侯娟娟 张志峰 张吉平 席维岳 郑红军 赵海燕 李 娟

(庆阳市人民医院检验科，庆阳 745000)

目的应用PCR-荧光探针法分析庆阳地区丙型肝炎患者基因型，并对PCR-荧光探针法的各种性能进行评价。方法收集庆阳地区289例各种丙型肝炎患者的临床资料和外周静脉血，采用PCR-荧光探针法检测其基因型，并和PCR-反向点杂交法、测序法进行比较。结果289份HCV RNA 阳性血清标本中，PCR-荧光探针法基因型及亚型检出率为99.3%(287/289),其中1b型139例(48.1%)，2a型136例(47.1%)，3a型7例(2.4%),3b型5例(1.7%),未分出型2例(0.7%)。PCR-荧光探针法的特异度和准确度为100%，重复性良好，并与PCR-反向点杂交法、巢式PCR测序法分型结果均一致，三种方法的一致率为98.2%(56/57)，差异无统计学意义(P>0.05)。1b基因型患者ALT、AST、PLT和HCVRNA(lg)水平均高于2a基因型患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论庆阳地区HCV 基因型呈现多基因型分布特点，主要为1b 型和2a 型，且2a型和1b型的比例相当，呈现出2a 型比例升高，1b型下降的趋势；PCR-荧光探针法HCV基因分型敏感度和特异度高，方法简单,适合临床实验中应用。

PCR-荧光探针法；庆阳；丙肝；基因型

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大[1]。HCV基因分型在疾病的感染、传播、诊断、诊疗、预防等方面均有重要意义。虽然基因测序是HCV分型的金标准，但其操作繁琐、程序复杂、成本过高，难以对较大样本进行分析，因此在临床工作中不可行。近年，国内外文献报道的HCV基因分型方法有很多，但是均存在操作复杂、结果鉴定开放式或分管多步等缺陷[2]。本研究使用PCR-荧光探针法分析庆阳地区的丙型肝炎患者基因型，并对此方法的各种性能进行评价，以评估PCR-荧光探针法HCV基因分型在临床应用中的价值。

1 资料与方法

1.1资料 按照中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会制定的《丙型肝炎防治指南(2015更新版)》[3]，收集庆阳地区市医院和中医院传染科住院及门诊各种丙型肝炎患者289例(抗-HCV阳性，HCV RNA ≥ 5×103IU/ml),其中,男166例,女123例,年龄20～70岁,平均为(47.73 ± 16.54)岁。在治疗之前按照设计方案采取患者血液后分离血清，-70℃保存，用于后续检测。排除标准：(1)抗-HCV阳性、HCV RNA<5×103IU/ml；(2)合并其他病毒感染：HAV、HBV、HEV、CMV、EB；(3)合并免疫性、药物性、酒精性、中毒性疾病及肝损害者。

1.2方法

1.2.1血液学指标的采集与检测 抽取静脉血，用日本AU2700全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)；用mindray BC-5800血球分析仪测定白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)。

1.2.2HCVRNA检测 试剂为中山大学达安基因股份有限公司提供，方法为 RT-PCR-荧光探针法，仪器为 ABI 7500 荧光PCR 扩增仪。

1.2.3PCR-荧光探针分型法 采用厦门泰普生物科学有限公司生产的HCV基因分型检测试剂盒进行检测。选取HCV五种亚型的保守区域，设计相应的特异性引物和探针，运用一步法RT-PCR技术和Taqman荧光探针技术，实时检测五种HCV亚型(1b、2a、3a、3b和6a)特异性探针的荧光信号。所用仪器为ABI 7500荧光PCR扩增仪。

1.2.3.1RNA提取 采用泰普生物HCV分型试剂盒所配套的核酸提取试剂提取病毒核酸，严格按照试剂盒操作说明书进行操作。

1.2.3.2PCR 扩增 往40 μl各组反应体系中(1b亚型组、2a/6a亚型组、3a/3b亚型组 HCV RT-PCR 反应液38 μl和酶系2 μl)分别加入样本或质控品的RNA提取产物各10 μl，混匀，总反应体积50 μl；然后将待测PCR反应管小心置于PCR扩增检测仪中。按下列程序条件扩增：42℃ 30 min；95℃ 3 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，10个循环；94℃ 15 s，60℃ 45 s，30个循环。荧光探针参数设置：所有检测孔均设置为FAM-TAMAR 和JOE-TAMAR，在60℃ 45 s 阶段收集荧光信号。

1.2.3.3结果判断 反应结束后，根据分析后图像调节Baseline 的Start 值、End 值以及Threshold 值。点击Analysis 自动获得分析结果，在Report界面察看结果。

1.2.4PCR-反向点杂交法 采用RT-PCR 体外扩增法结合反向点杂交技术，由中山达安基因公司生产的HCV基因分型试剂盒检测(具体操作详见说明书)。

1.2.5测序分型 采用巢式PCR方法进行扩增，扩增产物采用2%琼脂糖电泳进行确认有预期目的条带后送上海生工公司进行测序。

2 结果

2.1PCR-荧光探针法基因分型结果 289份HCV RNA 阳性血清标本中，PCR-荧光探针法基因型及基因亚型检出率为99.3%(287/289)，2例HCV 基因分型不确定。287份基因分型明确标本中，其中1b型139例(48.1%)，2a型136例(47.1%)，3a型7例(2.4%),3b型5例(1.7%)。具体结果判断如下。见图1。

2.2PCR-荧光探针法的敏感度、特异度、准确度和重复性 289 份标本中除2例HCV 基因分型不确定外，其余均被PCR-荧光探针法检出，最低检出量为 5×103IU/ml。 30 份HBV DNA阳性、HCV RNA 阴性血清标本分型均为阴性，特异度为100%。以测序结果为金标准，PCR-荧光探针法明确分型的55份标本与测序分型完全一致，准确度为100%(55/55)。对其中30份已分出型(1b型17例，2a型13例)的丙型肝炎患者血清标本进行PCR-荧光探针法重复分型检测，两次检测结果一致，并且其CV值<10%。

2.3PCR-荧光探针法与PCR-反向点杂交法、测序结果的对比 对PCR-荧光探针法明确分型的55份标本和2例基因分型不确定的标本，进行PCR-反向点杂交法、巢式PCR测序法检测。三种结果比较发现，PCR-荧光探针法明确分型的55份标本，PCR-反向点杂交法、巢式PCR测序法分型结果与其均一致。2例基因分型不确定的标本，PCR-反向点杂交法也未能分型，测序法分型其中1例3a型，另外1例也未分出型。三种分型方法的一致率为98.2%(56/57)，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图1 PCR-荧光探针法HCV基因分型结果Fig.1 Genotype for hepatitis C by PCR-fluorescent probe Note: A. FAM channel positive curve; B. JOE channel positive curve.

表2 不同基因型的丙型肝炎患者部分临床指标比较

表1 PCR-荧光探针法与PCR-反向点杂交法、测序法分型结果的比较(例)

2.4不同基因型的丙型肝炎患者治疗前部分临床指标比较 289 例慢性丙型肝炎患者中，1b 基因型患者 ALT、AST、PLT 和 HCVRNA(lg)水平均高于 2a 基因型患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。1b 基因型和2a 基因型患者的 WBC 和 Hb 水平比较无统计学差异(P>0.05)。3a有8例，3b有5例，不参与比较。见表2。

3 讨论

HCV呈全球性流行，不同性别、年龄、种族人群均对HCV易感[4]。据WHO统计，全球HCV的感染率约为3%，估计约1.85亿人感染，每年因HCV感染导致的死亡病例约35万例[5,6]。HCV基因组呈现高度异质性,根据HCV基因组核苷酸序列的差异程度,可将HCV分为6个基因型和70多种亚型[7,8]。

我国HCV感染者不同地区、不同人群的基因型及亚型分布有很大差异。苏迎盈[9]、聂红明等[10]最新研究表明，中国流行最广泛的HCV基因亚型为1b及2a，以1b型为主，基因2a型的比例由南向北逐渐增高；北方地区基因型较单一，以1b和2a型为主；南方地区以1b型为主，2a、3a、3b及6a型各自占较大比例；随着时间推移，全国各地亚型类型逐年增多。本研究发现，甘肃省庆阳地区HCV基因型呈现多基因型分布特点，和我国北方大部分地区略有不同，以1b型和2a型为主，但2a型和1b型的比例相当，其中1b型139例(48.1%)，2a型136例(47.1%)，呈现出2a 型比例升高，1b型下降的趋势，这和彭雪彬等[11]报道有部分一致性。其他亚型相对较少，3a型为2.8%(PCR-荧光探针法检出7例，测序法检出1例),3b型为1.7%。说明庆阳地区近几年由于流动人口、献血者、涉毒人员等因素，HCV基因型分布状况在迅速发生改变。本研究同时发现1b基因型患者ALT、AST、PLT和HCVRNA(lg)水平均高于2a基因型患者(P<0.05)，而1b 基因型和2a 基因型患者的WBC和Hb 水平比较无统计学差异,和聂红明等[12]报道一致。ALT 和AST可以提示肝脏炎性反应的程度，不同基因型患者肝细胞损害的严重程度可能也有差别，1b型患者可能更容易出现肝脏损害。

HCV RNA基因分型结果有非常重要的临床意义，有助于判定HCV治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案。基因测序被认为是目前HCV分型的金标准，但其操作繁琐、程序复杂、成本过高，难以对较大样本进行分析，因此在临床工作中不可行。近年来有一些新的HCV 分型方法相继被报道，如限制性片段长度多态性(RFLP)分析法、型特异性引物PCR 法、型特异性探针核酸杂交分析法和基因芯片法等，这些方法的特异度和灵敏度有较大差异，也存在仪器设备复杂、操作繁琐、检测时间长、成本高等缺点，亦不能满足临床需求[13]。本研究采用PCR-荧光探针法分析庆阳地区HCV患者基因型，289 份标本中除2例HCV 基因分型不确定外，其余均被PCR-荧光探针法检出。此方法的灵敏度高，特异度为100%，重复性良好，并且其CV 值<10%。与PCR-反向点杂交法、巢式PCR测序法比较，三种方法分型结果均一致，准确度为100%。2例基因分型不确定的标本，测序法分型其中1例3a型，可能是由于此标本3a亚型的浓度偏低以至于PCR-荧光探针法没有分出。综上所述，PCR-荧光探针法分型试剂各方面性能良好，可满足临床HCV 基因分型检测的需求，优于之前的类似研究[14]。

由于本研究纳入样本数量较少，在时间选择上比较局限，这些均有可能对研究结果造成一定的影响。在接下来的研究中，我们会进一步对PCR-荧光探针法分型试剂的性能评价、庆阳地区HCV基因型分布特征、HCV基因型临床意义等进行大样本的分析研究。

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[2] 马洪滨，李永利，刘立明，等.HCV RNA 基因分型多色荧光PCR 筛查和确认方法的建立[J].中国临床医师杂志(电子版)，2012，6(1)：82-86.

[3] 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.丙型肝炎防治指南(2015更新版)[J].中华肝脏病杂志，2015,23(12)：906-923.

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[9] 苏迎盈，刘慧鑫，汪 宁.中国丙型肝炎病毒基因型分布[J].中华流行病学杂志，2013，34(1)：80-84.

[10] 聂红明，陈建杰，汪 蓉，等.中国汉族人群慢性丙型肝炎病毒基因型分布规律研究[J].中华流行病学杂志，2012，33(5)：501-504.

[11] 彭雪彬，毛小荣，陈 红.甘肃地区汉族HCV 基因分型相关分析[J].临床肝胆病杂志，2013，29(11)：828-831.

[12] 聂红明，陈建杰，董慧琳，等.我国丙型肝炎病毒基因1 型与非基因1 型的临床特征分析[J].临床肝胆病杂志，2012，28(6)：439-442.

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[14] 袁小珍，陈伟烈，魏绍静，等.实时荧光PCR技术在丙型肝炎病毒基因型检测中的应用[J].广东医学，2011，32(5)：582-584.

[收稿2017-04-16 修回2017-06-29]

(编辑 张晓舟)

·启事·

《临床肝胆病杂志》2018年征稿征订

《临床肝胆病杂志》于1985年创刊。是中华人民共和国教育部主管、吉林大学主办、中华医学会肝病学分会学术支持的我国首个肝胆胰疾病专业杂志。刊号ISSN 1001-5256，CN 22-1108/R。

本刊在2016年《中国科技期刊引证报告(核心版)》中影响因子为1.127；在扩展版中影响因子为1.428。在15种消化病学类核心期刊中，影响因子和综合评价总分均位列第三。

本刊为“中国科技论文统计源期刊”(中国科技核心期刊)。被俄罗斯《文摘杂志》(AJ)、美国《化学文摘》(CA)、美国《剑桥科学文摘》(CSA)、波兰《哥白尼索引》(IC)、英国《国际农业与生物科学研究中心》(CABI)、世界卫生组织《西太平洋地区医学索引》(WPRIM)等海内外二十家数据库收录。

本刊设有述评、防治指南、专家论坛、论著、病例报告、综述、学术争鸣、临床病例讨论、国外期刊精品文章简介等栏目。刊载内容实行肝胆胰并重、内外科并重、中西医并重、临床与基础并重，欢迎投稿。

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GenotypingofhepatitisCvirusbyPCR-fluorescentprobeinQingyangarea

HOUJuan-Juan,ZHANGZhi-Feng,ZHANGJi-Ping,XIWei-Yue,ZHENGHong-Jun,ZHAOHai-Yan,LIJuan．
ClinicalLaboratory,thePeople′sHospitalofQingyangCity,Qingyang745000,China

Objective:To detect the genotyping of hepatitis C virus by PCR-fluorescent probe in Qingyang area,and to evaluate the performance of PCR-fluorescent probe.MethodsThe clinical data and peripheral venous blood of patients with HCV were collected(n=289).PCR-fluorescent probe was used to detect the genotype and HCV RNA of hepatitis C virus,and compare with PCR reverse dot blot,RT nested-PCR.ResultsAmong 289 samples detected by PCR-fluorescent probe,the rate of genotyping of hepatitis C virus was 99.3%(287/289)，and 139 for 1b(48.1%)，136 for 2a(47.1%)，7 for 3a(2.4%)，5 for 3b(1.7%),2 for unknow(0.7%).The specificity and efficiency was 100%,better repeatability,consistent with PCR reverse dot blot and RT nested-PCR(98.2%,P>0.05).The ALT,AST,PLT and HCVRNA(lg)for 1b patients was higher than 2a(P<0.05).ConclusionMulti-genotype distribution of HCV was revealed in the hepatitis C patients of Qingyang,1b and 2a were the main genotypes,and the ratio was equal，2a was increased,1b was declined．The sensibility and specificity was higher for PCR-fluorescent probe,and could be used in clinic.

PCR-fluorescent probe method;Qingyang;Hepatitis C virus;Genotype

①本文为甘肃省卫生行业科研计划项目(GSWSKY-2014-49)。

R446.9R512.6

A

1000-484X(2017)10-1526-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.017

侯娟娟(1983年- )，女，硕士，副主任检验师，主要从事临床免疫学与分子生物学方面研究，E-mail:997336471@qq.com。