β—淀粉样蛋白增加Wistar大鼠癫痫发作易感性的行为学研究

赵娟　张彦妹　郑乃智

[摘要] 目的 研究β-淀粉樣蛋白（Aβ）对癫痫（EP）发病机制的影响。 方法 按随机数字表法将40只6～8周Wistar大鼠分为Aβ1-42+PILO组、Aβ1-42组、PBS+PILO组、PBS组，每组各10只；前两组合称为Aβ1-42模型组，后两组合称为PBS对照组。采用脑立体定位仪在Aβ1-42模型组大鼠海马CA3区注入Aβ1-42，PBS对照组给予相同剂量的PBS。2周后观察大鼠Morris水迷宫实验，记录逃避潜伏期、目标象限内游泳时间比例和穿越平台次数，检测大鼠AD模型是否成功。建模成功后通过腹腔（IP）注射氯化锂-匹罗卡品（LI-PILO）制备大鼠慢性EP模型，依据Racine分级标准，记录EP发作潜伏期、发作程度和死亡率。 结果 Aβ1-42模型组和PBS对照组各有1只大鼠死亡。Morris水迷宫实验数据分析结果，Aβ1-42 模型组与PBS对照组大鼠相比，逃避潜伏期显著延长（P < 0.01），目标象限内游泳时间比例缩短（P < 0.05），穿越平台次数显著减少（P < 0.05），表明AD模型制备成功。制备大鼠EP模型：依据Racine分级标准，Aβ1-42+PILO组与PBS+PILO组相比，EP发作潜伏期显著缩短（P < 0.01），发作程度更重（P < 0.05）；Aβ1-42+PILO组与PBS+PILO组相比死亡率显著增加（P < 0.05）。 结论 通过海马CA3区注射Aβ1-42，可以导致大鼠出现与海马有关的学习和记忆功能受损。在Aβ存在的基础上诱导大鼠出现EP发作的易感性增加。

[关键词] β-淀粉样蛋白；癫痫；阿尔茨海默病；易感性

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（c）-0025-05

[Abstract] Objective To study the effects of β-amyloid protein （Aβ） on the pathogenesis of epilepsy （EP）. Methods 40 male Wistar rats were divided into Aβ1-42 + PILO group， Aβ1-42 group， PBS + PILO group and PBS group by random number table， with 10 rats in each group. The former two groups were called Aβ1-42 model group and the later PBS control group. Aβ1-42 and same volume PBS were injected into the hippocampal CA3 region of Wistar rats in Aβ1-42 model group and PBS control group by stereotaxic apparatus respectively， and the Morris water maze test was observed after 2 weeks. Escape latency， the percentage of swimming time in the target quadrant and the number of times of crossing the platform were recorded. After the AD model was successfully made， the rat model of chronic EP was established by intraperitoneal injection of LI-PILO. The latency of EP， degree of seizure and mortality of rats were recorded according to Racine grading criteria. Results One rat died in Aβ1-42 model group and the PBS control group. The results of Morris water maze test showed that compared with the PBS control group， the escape latency of the Aβ1-42 model group was longer （P < 0.01）， the proportion of swimming time in the target quadrant was shorter （P < 0.05）， and the number of crossing the platform was also significantly reduced （P < 0.05）. It indicated that the AD model was successfully prepared. Preparation of rats EP model： The latency of EP in Aβ1-42 + PILO group was significantly shorter （P < 0.01）， and the degree of seizure was more severe （P < 0.05）， compared with PBS + PILO group， according to Racine grading criteria. The mortality of rats in Aβ1-42 + PILO group was significantly increased compared with PBS + PILO group （P < 0.05）. Conclusion It can lead to the impaired hippocampus-related learning and memory function by injection of Aβ1-42 in hippocampal CA3 region of rats. The existing of Aβ increasing the susceptibility to EP in the rats， which indicates that Aβ plays a facilitation role in the occurrence of EP.endprint

[Key words] Beta amyloid protein； Epilepsy； Alzheimer disease； Susceptibility

癫痫（EP）是神经科常见疾病，长期EP发作导致近40%的患者出现认知功能障碍，且EP患者意外死亡的风险比普通人群高2～3倍[1-2]。近40年来老年患者占EP患者比例越来越高，继卒中后癫痫（PSE）发病率升高之外，EP和阿尔茨海默病（AD）之间的共病现象也得到越来越多的重视[3]。EP和AD之间相关性研究成为神经科学领域讨论的热点问题。本研究目的主要是通过动物实验，在行为学方面，研究β-淀粉样蛋白（Aβ）导致EP发作易感性增加及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组

选择SPF级雄性Wistar大鼠40只（动物合格证号：SCXK（鲁）20140007），周龄为6～8周，体重为200～220 g，每笼3～4只；室温保持（24±2）℃，室内湿度维持55%左右，12 h昼/夜循环灯光环境中，可自行获取固体食物和水，观察无自主EP发作入选。采用随机数字表法将动物分为4组，分别为Aβ1-42+PILO组、Aβ1-42组、PBS+PILO组、PBS组，每组各10只大鼠，前2组合称为Aβ1-42模型组，后2组合称为PBS对照组。所有操作程序均符合青岛大学动物伦理委员会规定标准。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 β-淀粉样蛋白，批号：SCP0038，匹罗卡品，批号：1538902，氯化锂，批号：746460，均购自美国Sigma公司。

1.2.2主要仪器 动物脑立体定位仪，型号：902-A，购自美国KOPF公司；Morris水迷宫视频分析系统，型号：SMART3.0，购自西班牙Panlab。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠AD模型的制备 参照文献[4]方法，Aβ1-42模型组给予10%的水合氯醛400 mg/kg IP注射进行麻醉。将微量注射器固定在定位仪上，硬膜下进针深度3.0 mm，吸入5 μL聚集态的Aβ1-42，微量器以1 μL/min速度垂直慢慢推入双侧海马CA3区，药物完全进入后，为使溶液足以完全进入，留针5 min后，缓慢拔出以免药物溢出。PBS对照组大鼠按上述方法给予相同剂量的PBS。

上述实验结束14 d后，用Morris水迷宫（MWM）实验检测AD模型是否成功。根据参考文献[5]方法，本实验设定跟踪时间为2 min，当到达设定时间或者大鼠已经成功到达平台停止跟踪记录。水迷宫实验持续7 d。前6 d，是大鼠的定位航行实验，每天上午和下午各训练2次，共4次，每次训练在对角象限内面向水池壁放入水中，大鼠若在2 min内不能发现平台，就将其带领到平台上保持15 s，并终止此次训练。若2 min的任意时间，大鼠能找到平台，使其停留在上面15 s，后终止此次训练。测定大鼠到达平台的时间，记作逃避潜伏期，此项检测动物学习能力；实验进行第7天，移出池内平台，让大鼠面向池壁选择在第Ⅱ象限内入水，保证其自由游泳时长持续2 min。记录每只大鼠在2 min内穿过原平台位置（即第Ⅲ象限中央）的次数和在原平台位置滞留时间与总游泳时长比例，用于动物记忆能力评估。

1.3.2大鼠EP模型的制备 构建AD模型成功后，Aβ1-42+PILO组与PBS+PILO组，通过IP注射LI-PILO制备慢性EP动物模型，参考文献[6]方法，注射PILO后观察大鼠的行为学改变，依据Racine（1972）分级标准[7]将大鼠惊厥发作分为0～Ⅴ级，发作程度0级，评分记6分，发作程度Ⅰ级，评分记5分，以此类推，发作程度Ⅴ级，评分记1分。若在30 min内大鼠不能到达Ⅳ级及以上发作，再次注射PILO 10mg/kg，以后每15分钟给药1次，可连续追加5次，直到大鼠出现Ⅳ～Ⅴ级发作进入癫痫持续状态（SE）。SE维持90 min后，给予IP注射地西泮10 mg/kg控制EP发作，降低死亡率。若给予地西泮后，30 min内SE未能终止发作，可再次给予地西泮10 mg/kg IP注射，直到SE发作停止，最多3次。记录大鼠EP发作达到Ⅳ级及以上的潜伏期（Ⅱ级以上发作为准），发作程度和死亡率。模型制备成功后，采用自动视频检测系统观察大鼠的行为变化并记录有无慢性反复自发性发作（SRS）[8]，观察时间为8∶00～20∶00。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠AD模型结果

注射Aβ1-42后，当天Aβ1-42+PILO组大鼠死亡1只；注射PBS后，第2天PBS+PILO组大鼠死亡1只。推测死亡原因系大鼠个体差异导致对药物及手术不耐受。2周后进行MWM实验，Aβ1-42模型組与PBS对照组相比，逃避潜伏期显著延长（P < 0.01），表明Aβ1-42模型组大鼠学习能力下降；目标象限内游泳时间减少（P < 0.05），穿越平台的次数显著减少（P < 0.05），提示Aβ1-42组大鼠记忆能力下降，说明AD模型制备成功。见表1。

2.2 大鼠EP模型结果

大鼠在IP注射PILO 5min后表现出外周胆碱能症状，同时或先后出现EP发作症状。见图1。

2.3 两组大鼠EP发作潜伏期比较

与PBS+PILO组相比，Aβ1～42+PILO组达到Ⅳ级及以上发作所需时间显著缩短（P < 0.01）。见图2。

2.4 两组大鼠EP发作程度比较

实验中，在15 min内，Aβ1-42+PILO组有6只大鼠达到Ⅴ级发作，而PBS+PILO组仅有1只大鼠达到Ⅴ级发作。两组大鼠EP发作程度比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。endprint

2.5 两组大鼠存活情况比较

实验中，Aβ1-42+PILO组的大鼠有5只在实验尚未结束时死亡，存活4只；PBS+PILO组没有出现死亡的大鼠，存活9只；经Fisher确切概率法分析，Aβ1-42+PIL0组大鼠死亡率较高（P < 0.05）。

3 讨论

3.1 实验动物模型选择

AD最典型的的病理改变之一，是Aβ的沉积和自聚在细胞外形成SP，Aβ的过量产生和毒性作用是AD发生的重要环节[9]。本研究通过海马CA3区注射Aβ制备AD模型，用行为学观察指标MWM记录大鼠注射Aβ1-42 2周后学习和记忆能力相关数据，分析两组数据，得出Aβ1-42组较PBS组逃避潜伏期显著延长（P < 0.01），目标象限内游泳时间减少（P < 0.05），穿越平台的次数显著减少（P < 0.05），以上实验结果复制AD发病的相关机制及临床表现，使实验获得理想的AD动物模型[10-11]。在癫痫发病机制研究中，本研究采用LiCl-PILO诱发大鼠慢性EP发作的模型是一种SE模型，通过兴奋脑内M胆碱能受体激活谷氨酸兴奋性通路，引起海马内兴奋性和抑制性功能失衡，出现SE。这种联合用药模型，通过大剂量LiCl（127 mg/kg，ip）大大减少PILO的用量，减轻PILO外周胆碱能作用，使EP模型的成功率增高，死亡率降低。本实验大鼠在注射LiCl-PILO后，逐渐表现出以上发作过程，复制人类SE相似的临床特征，获得EP发病机制研究较理想的模型[12]。

3.2 Aβ增加AD患者癫痫发作机制

与实验预期的结果一致，在Aβ1-42+PILO组大鼠EP发作潜伏期显著缩短，发作程度重，说明Aβ的存在导致大鼠EP发作的易感性增加。这些发现支持癫痫发病机制的“二次打击”学说，即二次脑损伤导致啮齿类AD动物模型EP的发生[13]。在这些大鼠中，Aβ的增加作为第一次打击，发生在EP发作过程中的脑损伤初期，Aβ的沉积使得神经元过度兴奋，神经网络易受EP样活动的影响[14]。Aβ有助于过度活动的持续存在[15-16]。在Aβ1-42+PILO组中，EP发作相关的死亡增加值得关注。当前证据表明，AD患者可能会增加EP发作的死亡。尽管目前还不清楚AD是否可以增加癫痫非预期性死亡的危险性[16]。但如果该研究被证实，在未来的探索中，这可能代表一种新的EP非预期性死亡发病机制。

3.3 Aβ和异常兴奋的神经网络

Palop等[17-18]通过hAAP转基因AD动物模型实验证实，海马是Aβ起始位置。海马神经元早期的“点燃”归因于可溶性Aβ的沉积。既往许多实验研究均发现，在AD的多种小鼠模型中通过EEG检测出海马和皮层频繁发放EP样尖波和/或棘波节律，尤其是在Aβ沉积的部位。这些模型不仅在EEG上表现出亚临床EP样活动，在AD早期病程中也可表現出EP发作[19]。由此可见，EP和AD早期发病机制具有相关性。脑部神经元的过度兴奋是发生在AD早期的重要病理机制，并且在AD患者引起异常兴奋的神经网络。因此，认知功能障碍可能和脑部异常兴奋的神经元有着密切联系。随后研究结果表明，在AD疾病早期且发病年龄较小者即可表现出EP发作，与上述研究吻合。Palop等[18]随后实验结果表明，Aβ沉积导致海马神经元兴奋性异常升高，代偿性地造成该区域抑制性神经元兴奋，引起整个神经网络的电活动不平衡，上述代偿机制造成海马区域内有关学习和记忆的神经元及神经突触功能受到抑制，从而导致学习记忆能力下降。以上研究表明，Aβ的过量沉积可能会导致神经环路重构，引起神经网络的兴奋异常增高。

EP和AD的相关性已有越来越多的基础实验及临床研究证实，从发病机制到临床表现的多种共病现象，尤其是病理学机制也受到极大关注，也是未来的研究方向[20]。

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（收稿日期：2017-06-25 本文编辑：李岳泽）endprint