医用可降解 Mg-Zn-Sr合金材料体内外生物安全性评价*

甘雨1 赵晶凤2 马杰1* 刘小虎1

论著·实验研究

医用可降解 Mg-Zn-Sr合金材料体内外生物安全性评价*

甘雨1 赵晶凤2 马杰1* 刘小虎1

目的评价医用可降解Mg-Zn-Sr合金材料的体内外生物安全性，初步探讨其作为骨科植入材料的可行性。方法参照国际ISO10993标准和国内GB/T16886标准，对Mg-Zn-Sr合金进行小鼠体内急性全身毒性试验和体外细胞毒性试验研究，记为合金组，对照组自小鼠尾静脉注射0.9%氯化钠溶液。结果Mg-Zn-Sr合金浸提液经静脉注射后，在即时、4、24、48、72 h后动物一般状态均良好，未见毒性反应及死亡情况，合金组和对照组体质量相对增长率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；各浓度浸提液组细胞生长状况良好，细胞数目和形态与阴性对照组相似，各浓度浸提液组A值与阴性对照组A值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），细胞相对增值率（RGR值）介于（90.98%～107.15%）之间，毒性评价为0～1级。结论Mg-Zn-Sr合金无急性全身毒性反应，无细胞毒性作用，符合医用生物材料安全性要求，有望成为新型骨科植入材料。

Mg-Zn-Sr合金；生物材料；急性全身毒性；细胞毒性

目前，临床上广泛应用的不锈钢、钛合金等骨科内固定材料普遍存在应力遮挡效应和二次手术取出的问题，增加了患者的痛苦和经济负担 [1]。镁作为一种新型可降解金属材料，具有良好的生物相容性和力学特性，弹性模量接近人骨，能有效降低应力遮挡效应，成为具有潜在优势的新型骨科植入材料 [2]。但由于镁在人体环境中降解太快，无法满足骨科治疗需求，限制了其在临床上的应用。本课题组在镁金属中加入锌（Zn）、锶（Sr）组成Mg-Zn-Sr合金，提高了其抗腐蚀性和力学性能，使其有望应用于骨科治疗领域。为初步评价该材料的生物安全性，本研究对其体内急性全身毒性和体外细胞毒性进行了研究，旨在为其进一步应用于临床提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

合金材料：Mg-3.06Zn-0.253Sr（质量分数），由东北大学材料与冶金学院提供，材料加工成直径16.00mm，厚2.60 mm的圆片状；KM小鼠，SPF级，体质量18g～22g，雌雄各半，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2015-0001；大鼠成骨MC3T3-E1细胞，购自江苏齐氏生物科技有限公司。

1.2 试剂及仪器

DME/F-12培养基（批号：AB216498，美国Hyclone公司），PBS（批号：NAH1449，美国Hyclone公司），胎牛血清（批号：20151118，浙江天杭 生物科技股份有限公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（批号：20131105，北京索莱宝科技有限公司），青霉素/链霉素原液（批号：20150624-273，中国医学科学院生物医学工程研究所），MTT（批号：nc0793-250，杭州纳川生物科技有限公司）。电热恒温培养箱(厦门医疗电子仪器厂)，CO2细胞培养箱(Thermo公司，美国)，超净工作台 (Thermo公司，美国)，酶标仪 (Thermo公司，美国)，倒置显微镜 (Olympus公司，日本)。

1.3 方法

参照ISO10993-12:2002和GB/T16886:2003标准[3]，取消毒后合金材料计算表面积，按1.25 cm2/mL的比例加入0.9%氯化钠溶液，在电热恒温培养箱中以37℃浸泡72 h。分组及给药

取健康KM小鼠20只，随机分为合金组和对照组，每组10只，雌雄各半。合金组自小鼠尾静脉注射合金浸提液，对照组自小鼠尾静脉注射0.9%氯化钠溶液，给药剂量均为50 mL/kg，以低于0.1 mL/s的恒定速度注射。观察指标

于注射后即时、4、24、48、72 h观察和记录两组动物的一般状态，毒性反应及死亡情况。并于72 h称量动物体质量，计算体质量相对增长率，体质量相对增长率=(72h体质量－实验前体质量)/实验前体质量×100%。若合金组中有≥2只动物出现毒性反应（明显的腹部刺激症状、抽搐、震颤、发绀、呼吸困难等）或死亡，≥3只动物出现体质量下降超过10%，则可判定合金材料有急性全身毒性。

将Mg-Zn-Sr合金材料依次置于90%乙醇、蒸馏水中超声清洗各10分钟，再经121℃高压蒸汽灭菌20分钟。参照ISO10993-5:2009标准，取消毒后合金材料计算表面积，按1.25 cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的DME/F-12培养液，在恒温培养箱中以37℃浸泡24h。浸提原液为100%浓度，再用DME/F-12培养液分别稀释成50%、25%和12.5%三个浓度的材料浸提液，最后用0.22 m微孔滤膜过滤除菌备用。

取传代生长旺盛的大鼠成骨细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为2×104个/mL。以每孔100 L接种于96孔培养板中，共接种3板。置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，24 h后弃去原培养液，PBS冲洗。分别加入100%、50%、25%和12.5%的材料浸提液，以含10%胎牛血清的 DME/F-12培养液为阴性对照，每孔100 L，每组设6个平行孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。

分别于24、48、72 h各取出1块细胞培养板，在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。然后每孔加入10 L浓度为5%的四甲基偶氮噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]溶液，37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。4h后弃去孔内液体，每孔加入100 L二甲基亚砜，在摇床上低速振荡3 min，采用Thermo酶标仪在490nm波长处检测吸光度值 (A值)。按下式计算细胞相对增值率 (RGR):RGR值=浸提液组A值/阴性对照组A值×100%。并参照GB/T16886.5-2005标准评定细胞毒性：RGR值≥100%为0级，RGR值介于75%～99%为1级，50%～74%为2级，25%～49%为3级，1%～24%为4级。

1.4 统计学处理

所有研究数据均采用DAS2.1.1软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体内急性全身毒性试验

注射后在各时间点动物一般状态均良好（见图1），未见毒性反应及死亡情况，72 h内动物体质量无1只下降，两组体质量相对增长率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表 1）。

图1 体内急性全身毒性试验小鼠一般状态。A：对照组(72h)，B：合金组(72 h)。

表1 两组动物体质量变化情况比较（,g）

表1 两组动物体质量变化情况比较（,g）

组别10 n 实验前 72小时 相对增长率(%)合金组 20.50±1.18 23.50±1.51 14.69±5.16对照组 10 20.70±1.25 24.10±1.97 16.42±5.87 t值 0.368 0.764 0.700 P值 0.717 0.454 0.494

2.2 体外细胞毒性MTT试验

各浓度浸提液组细胞镜下观察呈长梭形或多角形，贴壁生长，生长状况良好，细胞数目和形态与阴性对照组相似（见图2）。经酶联免疫吸附法检测，各浓度浸提液组A值与阴性对照组A值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。通过计算得出RGR值介于 (90.98%～107.15%)之间，毒性评价为0～1级（见表3），符合医用生物材料毒性要求，而且随着时间的延长毒性级别并无增长，提示Mg-Zn-Sr合金对大鼠成骨细胞生长增殖无显著影响，呈现出良好的生物相容性。

表2 各浓度Mg-Zn-Sr合金浸提液不同培养时间A值比较（s）

表2 各浓度Mg-Zn-Sr合金浸提液不同培养时间A值比较（s）

0.147±0.030 0.212±0.029 0.198±0.052 12.5%浸提液 6 0.232±0.071 0.215±0.085组别 n 24小时 48小时 72小时6 0.141±0.021 0.181±0.051 0.200±0.063 100%浸提液 6 0.144±0.022 0.215±0.055 0.213±0.080 50%浸提液 6 0.128±0.015 0.193±0.028 0.192±0.057 25%浸提液 6 0.134±0.016阴性对照

表3 各浓度Mg-Zn-Sr合金浸提液RGR值及毒性评价

图2 大鼠成骨细胞在不同浓度Mg-Zn-Sr合金浸提液中的细胞形态（×100）。A：阴性对照组(72 h)，B：100%浸提液组(72 h)，C：50%浸提液组(72 h)，D：25%浸提液组(72 h)，E：12.5%浸提液组(72 h)。

3 讨论

理想的骨科植入材料需满足降解速度与组织再生速度相匹配的要求，金属镁虽具有较好的可降解性及生物相容性，但降解速度过快，在组织愈合前就过早的失去机械完整性，无法满足骨科治疗需求，因此，延缓镁的降解速率一直是医用镁金属材料研究的热点和难点 [4]。金属 Zn、Sr是人体必需的微量元素，对人体生长发育具有重要的调节作用，有研究发现，这两种金属元素还能促进成骨细胞增殖和分化，增强组织再生 [5]。更重要的是，在镁金属中以一定比例加入Zn、Sr组成Mg-Zn-Sr合金材料，其降解速度大幅减缓，强度和塑韧性大幅提升，使其有希望成为新一代的骨科植入材料。

本课题组前期已对Mg-Zn-Sr合金材料的机械性能、物理性能和化学性能进行了大量的研究 [6,7]，本文将重点探讨其生物学性能。参照国际ISO10993标准和国内GB/T16886标准，本研究选择体内急性全身毒性试验和体外细胞毒性试验，以初步评价Mg-Zn-Sr合金的生物学性能。体内急性全身毒性试验是一种非特异性急性毒性试验，将材料浸提液经静脉、腹腔或灌胃给予动物，通过观察其生物学反应，判断材料是否有毒以及毒性的大小 [9]。本实验采用鼠尾静脉注射途径给予材料浸提液，使其直接进入血液循环，这是一种最直接和最快速暴露毒性的方法。结果显示，Mg-Zn-Sr合金浸提液静脉注射后，在即时、4、24、48、72 h动物一般状态均良好，未见毒性反应及死亡情况，72h内动物体质量无1例下降，两组体质量相对增长率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示Mg-Zn-Sr合金具有良好的生物安全性。

体外细胞毒性试验是目前医用金属材料生物学性能评价的最常用方法，具有实验周期短、重复性好、灵敏度高等优点 [10]，可通过镜下观察细胞形态、结构的改变以及增殖、凋亡情况，来判断金属材料的毒性。本研究选用合金材料植入部位的主要功能细胞-成骨细胞作为研究对象，与不同浓度Mg-Zn-Sr合金浸提液共同培养24、48、72 h后，用MTT法检测细胞数量及活力。结果显示各浓度浸提液组细胞生长状况良好，细胞数目和形态与阴性对照组相似；经酶联免疫吸附法检测，各浓度浸提液组A值与阴性对照组A值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；通过计算得出 RGR值介于(90.98%～107.15%)之间，毒性评价为0～1级，符合医用生物材料毒性要求，提示该合金材料具有良好的生物相容性。

综上所述，通过对Mg-Zn-Sr合金的体内急性全身毒性和体外细胞毒性试验研究发现，该材料无急性全身毒性反应，无细胞毒性作用，具有良好的生物安全性，在骨科治疗领域具有广阔的发展前景。

[1] 胡文雄，郭祥.钛合金板置入内固定修复老年肱骨远端骨折的生物相容性[J].中国组织工程研究，2016，20(13):1888-1894.

[2] Schwitalla AD,Spintig T,Kallage I,et al.Pressure behavior of different PEEK materials for dental implants[J].J Mech Behav Biomed Mater,2016,54:295-304.

[3] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T16886:2003医疗器械生物学评价[S].北京:中国标准出版社，2003.

[4] 许灏铖，张帆，吕飞舟，等.金属镁及其合金植入材料在脊柱外科中的应用[J].国际骨科学杂志，2016，37(5):269-273.

[5] 刘波，潘琦，王希明，等.镁锌合金促成骨细胞增殖作用及其相关机制研究[J].重庆医学，2012，41(35):3732-3736.

[6]冯建军，张雅静，左丽静，等.仿生涂层控制MgZnSrLa合金降解速率的研究[J].功能材料，2016，47(5):101-104.

[7] 张雅静，吴琴，左丽静，等.仿生涂层控制Mg-Zn-Sr合金的降解速率[J].东北大学学报(自然科学版)，2014，35(12):1715-1718.

[8] Zeng R,Cui L,Jiang K,et al.In vitro corrosion and cytocompatibility of a microarc oxidation coatingand poly(1-lactic acid)composite coating on Mg-1Li-1Ca alloy for orthopedic implants[J].ACS Appl Mater Interfaces,2016,8(15):10014-10028.

[9] Buratti FM,Manganelli M,Vichi S,et al.Cyanotoxins:producing organisms,occurrence,toxicity,mechanism of action and human health toxicological risk evaluation[J].Arch Toxicol,2017,91(3):1049-1130.

[10]Rao PC,Begum S,Jahromi MA,et al.Cytotoxicity of with asteroids:with ametelin induces cell cycle arrest at G2/M phase and mitochondria-mediated apoptosis in non-small cell lung cancer A549 cells[J].Tumour Biol.2016,37(9):12579-12587.

Biological safety assessment of medical degradable Mg-Zn-Sr alloy in vitro and in vitro

Gan Yu1,Zhao Jingfeng2,Ma Jie1,et al.1 The Second Hospital Affiliated to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine;2 Shenyang 242 Hospital,Shenyang Liaoning,110034,China

Objective To evaluate the biological safety of medical degradable Mg-Zn-Sr alloy in vitro and in vivo and explore the possibility of Mg-Zn-Sr alloy as anew type of orthopedic implant material.Methods According to the ISO10993 and GB/T16886,in vivo acute systemic toxicity tests and in vitro cytotoxicity tests were performed,alloy group was injected with Mg-Zn-Sr alloy extract,and negative control group was injected with 0.9% sodium chloride solution.Results When the Mg-Zn-Sr alloy extract was injected intravenously,the animals were in good condition,no toxic reaction and death after 0,4,24,48,72 h,respectively.There was no significant difference in the body mass relative growth rate between the two groups(P＞0.05).The cell growth condition with the addition of extracts of every concentration was good,and the number and morphology of cells were similar to those of the negative control group.There was no significant difference in the A value between the extract of every concentration group and the negative control group(P＞0.05).The value of RGR ranged from 90.98%to 107.15%,and the toxicity was evaluated from grade 0 to grade 1.Conclusion Mg-Zn-Sr alloy has no acute systemic toxicity,no cytotoxic effect.It is the medical biological material safety requirements,is expected to become a new type of orthopedic implant material.

Mg-Zn-Sr alloy;Biological materials;Acute systemic toxicity;Cytotoxicity

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.05.001

swgk2017-04-00075

R318.08

A

沈阳市科技计划项目(N0：F15-139-9-42）

1辽宁中医药大学附属第二医院；2沈阳二四二医院，辽宁沈阳110034

甘雨（1981-）男，硕士，副研究员。研究方向：药理学。

*[通讯作者]马杰（1962-），女，本科，研究员。研究方向：药理学。

2017-04-01）