复合磷酸钙颗粒溶解性能测试研究*

马春宝 李沅 景明 樊铂

复合磷酸钙颗粒溶解性能测试研究*

马春宝 李沅 景明 樊铂

目的研究复合磷酸钙颗粒（HA∶TCP=3∶7）在TRIS缓冲溶液中的体外溶解特性。方法配制一系列浓度逐级递增的Ca2+标准溶液，绘制Ca2+离子溶液的工作曲线。将复合磷酸钙颗粒（HA∶TCP=3∶7）置于pH值为7.4的TRIS缓冲溶液中浸泡，每小时取样一次（初始阶段每3分钟取样一次），用高速离心技术提取上层清液，采用电感耦合等离子体质谱法测定各时间点提取液的Ca2+浓度，绘制Ca2+浓度对浸泡时间的溶解曲线。结果Ca2+离子溶液的工作曲线的线性方程为y=4043.9x+23783，相关系数R为0.9999，方法检出限为0.0063 g/mL，定量限为0.021 g/mL。浸泡后最初的0.5h以内，Ca2+浓度随时间延长急剧升高，0.5h处有明显转折，0.5 h至20 h，Ca2+浓度仍随时间增加而升高，但是增加的速率较前0.5 h明显下降，20 h以后溶解达到基本平衡。复合磷酸钙颗粒的溶解过程分为3个阶段，首先是Ca2+离子浓度快速升高的溶解过程，第二阶段是Ca2+离子溶解与HA或CaHPO4·2H2O沉积的竞争过程，第三阶段是Ca2+离子浓度不再继续增加的稳定过程。结论 复合磷酸钙颗粒（HA∶TCP=3∶7）在TRIS缓冲溶液中的溶解具有一定的规律性，24 h后溶出的Ca2+离子浓度在1200 g/L左右。

磷酸钙；溶解行为；电感耦合等离子体质谱法

1 前言

羟基磷灰石，其标准钙磷原子比为1.67，与正常人体骨的钙磷比相当，而且其分子结构与人体骨的无机成分相似，具有良好的生物相容性[1]。目前已广泛应用于骨科植入物，牙科植入物和关节涂层等方面，并已形成国家标准和行业标准，如 YY 0305-1998[2]，YY 0303-1998[3]，GB/T 23101.2-2008[4]等。

2 仪器与试剂

电感耦合等离子体质谱仪（NexION300X型，美国Perkin-Elmer公司），pH计（FE20型，梅特勒-托利多仪器上海有限公司），水浴摇床（SW22型，德国优莱博公司）。复合磷酸钙颗粒（HA∶TCP=3∶7，韩国登腾公司），此种配比的复合磷酸钙颗粒临床应用最常见，是目前临床应用的主流产品。三羟甲基氨基甲烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），Ca离子标液（100g/mL，核工业北京化工冶金研究院），氯化钠（分析纯，天津市光复科技发展有限公司），氯化钙（分析纯，天津市光复科技发展有限公司），磷酸钾（分析纯，天津市光复科技发展有限公司）。

3 试验方法

3.1 标准溶液的配置

选取100 g/mL的Ca2+标液，使用2%的硝酸按质量法逐级稀释标准溶液，配制成浓度为300、600、900、1200、1500（ g/L）的标准系列溶液。

3.2 仪器优化与工作条件的确定

测试前使用 1g/L（Li、Be、Mg、Fe、In、Ce、Pb、U）的Setup溶液对仪器进行优化，确保优化评价的各项性能指标如灵敏度等达到仪器制造商的要求。本试验具体的工作条件和参数（见表1）。

表1 工作条件和参数

3.3 缓冲液配制

使用三（羟甲基）氨基甲烷，氯化钠，氯化钙，磷酸钾，配置在温度为（37±0.5）℃时，pH=7.4的TRIS缓冲溶液，并用pH计（测量前先用标准溶液进行标定）测量试验开始之前的pH值。

3.4 磷酸钙溶解试验

精确称取样品质量，依据美国标准 ASTM F1926-2014[13]的要求，按照材料质量（mg）/溶液介质体积（mL）比例为4：1的比例加入一定体积的 TRIS缓冲液。同样，依据美国标准ASTM F1926-2014的要求设定水浴摇床转速为（100±20）rpm，温度为（37±0.5）℃。分别于特定的时间间隔（最初的15 min，每3 min取样；15 min以后，每1 h取样。）取出容器，经高速离心分离，提取溶液部分作为待测样，测定各取样时间点Ca2+浓度，并绘制溶解速率曲线。

4 结果与讨论

4.1 标准工作曲线

按照前文中3.1的要求依次配制300、600、900、1200、1500（ g/L）的标准溶液，以信号强度对标准溶液浓度绘制曲线，并进行线性拟合，得到的线性方程为y=4043.9x+23783,相关系数R为0.9999。

检出限和定量限的计算需对试剂空白对照溶液进行10次测试，计算其标准偏差，并以此标准偏差的3倍值作为方法的检出限，以标准偏差的10倍值作为方法的定量限[14]。通过以上方法测得本试验的检出限为0.0063 g/mL，定量限为0.021 g/mL。

4.2 磷酸钙材料的溶解速率

分别于 3 min，6 min，9 min，12 min，15 min，1 h，2 h，3 h……24 h，取出溶解试验后的溶液，立即离心分离，取上层清液利用电感耦合等离子体质谱法测定溶液中的Ca2+离子浓度。以溶解时间为横坐标，溶出的Ca2+离子浓度为纵坐标，绘制磷酸钙材料的溶解曲线图。

图1 溶解的Ca2+离子浓度与浸泡时间

图2 第1阶段溶解

图3 第2阶段溶解

图4 pH值随浸泡时间变化

复合磷酸钙颗粒（HA∶TCP=3∶7）在pH值为7.4的TRIS缓冲溶液中浸泡，Ca2+离子浓度会随着浸泡时间的延长而产生变化。图1为复合磷酸钙颗粒（HA∶TCP=3∶7）浸泡在pH7.4的TRIS溶液中Ca2+离子的溶出速率变化。从图1和图2中可看出在最初的0.5h以内，Ca2+浓度随时间延长急剧升高，通过计算得到，0.5 h以内曲线的斜率为119.9。0.5 h处有明显转折，从图1和图3看出0.5 h至20 h，Ca2+浓度仍随时间增加而升高，但是增加的速率较前0.5 h明显下降，0.5 h至20 h曲线的斜率为25.3，是第一阶段的1/5，溶解速率下降接近4/5。20h以后溶解达到基本平衡。

一般认为HA溶解过程中在颗粒表面发生化学反应，首先发生如式（4.2.1、4.2.2）所示的化学反应，随着 OH-的释放和 H+的消耗，溶液的 pH值会逐渐升高，但由于式（4.2.1、4.2.2）反应速率很小，pH值升高幅度不大，最终趋于平衡，见图4。随着浸泡时间的延长和复合磷酸钙材料的溶解，其中HA相的结晶度会逐渐降低，浸泡24 h后，复合磷酸钙颗粒的结晶度下降4%，见图5。发生如式（4.2.3、4.2.4）所表示的化学反应。

磷酸三钙在pH值7.4的TRIS溶液中浸泡时，也会发生如式（4.2.3-4.2.5）的溶解反应，导致钙离子浓度的增加。这解释了溶解初期0.5 h，Ca2+离子浓度的快速升高。当溶解的Ca2+离子浓度达到过饱和的时候，就会发生HA或Ca-HPO4·2H2O的沉积反应（如式4.2.6、4.2.7）。沉积反应消耗了一部分 Ca2+离子，使得 Ca2+离子浓度增长速率放缓，随着新的Ca2+离子的不断溶解，以及溶解的Ca2+离子的沉积，最终Ca2+离子浓度在24h以后不再继续增加，而是达到一个稳定值。复合磷酸钙颗粒的溶解过程分为3个阶段，首先是Ca2+离子浓度快速升高的溶解过程，第二阶段是Ca2+离子溶解与HA或CaHPO4·2H2O沉积的竞争过程，[15]第三阶段是Ca2+离子浓度不再继续增加的稳定过程。

图5 复合磷酸钙颗粒不同浸泡时间的XRD图

5 结论

本文采用电感耦合等离子体质谱法测定了复合磷酸钙材料在pH=7.4的TRIS缓冲溶液中溶解的Ca2+离子浓度，发现在起初的0.5 h内Ca2+离子浓度急剧升高，发生了突释，此步骤即为复合磷酸钙材料的表面溶解过程，0.5 h后溶解速率放缓，此步骤为磷酸钙的溶解与HA或CaHPO4·2H2O沉积的竞争过程，沉积消耗了部分Ca2+离子，减缓了Ca2+离子浓度的升高速度。20h以后Ca2+离子浓度稳定在1200 g/L左右，此时磷酸钙的溶解与HA或CaHPO4·2H2O沉积达到了平衡的过程。总体来看，复合磷酸钙材料在 TRIS缓冲溶液中的溶解速率和溶出浓度具有一定的规律性。

[1]郑岳华，候小妹，杨兆维.多孔羟基磷灰石生物陶瓷的进展[J].硅酸盐通报，1995(3):20-24.

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[3] YY 0303-1998，医用羟基磷灰石粉料[S].

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[5] 李朝阳，杨德安，徐延献.可降解 -磷酸三钙的制备及应用[J].硅酸盐通报，2002，21(3):30-34.

[6] YY/T 0683-2008，外科植入物用 -磷酸三钙[S].

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The study on dissolution testing of Calcium phosphate composite particles

Ma Chunbao,Li Yuan,Jing Ming,et al.Supervision and Testing Center for Medical Devices of TianJin,TianJin,300384,China

Objective To study the dissolution characteristics of calcium phosphate composite particles(HA∶TCP=3∶7)in TRIS buffer solution.Methods A series of standard Ca2+solutions with increasing concentration are prepared,and the working curve of Ca2+ion solution was drawn.The composite calcium phosphate particles(HA∶TCP=3∶7)in the pH value for7.4TRIS buffer solution,sampling once per hour(initial samples were collected every3 min),extracted from the supernatant by high speed centrifugation,measured at each time point of the concentration of Ca2+extraction liquid by inductively coupled plasma mass spectrometry.The dissolution curve of Ca2+concentration on soaking time was drawn.ResultsThe linear equation of the working curve of Ca2+ionic solution is y=4043.9x+23783,and the correlation coefficient R is 0.9999.The detection limit is 0.0063 g/mL,and the quantitative limit is 0.021 g/mL.After the initial immersion within 0.5 h,the concentration of Ca2+increased with time dramatically,marked a turning point at 0.5 h,From 0.5 h to 2 h,the concentration of Ca2+ion increased with time,but the rate of increase decreased obviously compared with the first0.5h.After 20 h,the dissolution reached the basic balance.The dissolution process of calcium phosphate composite particles can be divided into 3 stages,the first is the dissolution process of Ca2+ion concentration increased rapidly,the second stage is the competition process of Ca2+dissolution with HA or CaHPO4·2H2O deposition,the third stage is the stable process of Ca2+ion concentration will no longer increase.Conclusion The dissolution of composite calcium phosphate particles(HA∶TCP=3∶7)in TRIS buffer solution has a certain regularity,and the concentration of Ca2+ions dissolved in 24h is about 1200 g/L.

Calcium phosphate;Dissolution behavior;ICP-MS

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.05.002

swgk2017-06-00138

R318.08

A

国家科技支撑计划课题“战略性新兴医疗器械产业关键技术标准研究”(课题编号：2015BAI44H01)

天津市医疗器械质量监督检验中心，天津300384

磷酸三钙，其标准钙磷原子比为1.50，与正常人体骨的钙磷比接近，不但具有良好的生物相容性，而且植入人体后能较快降解且降解产物对人体无毒害作用 [5]。磷酸三钙材料及产品目前已广泛应用于四肢、脊柱、骨盆等方面，填补那些由创伤或手术造成的腔洞状骨缺损，已形成的行业标准包括YY/T 0683-2008[6]等。

单一的羟基磷灰石或磷酸三钙材料均具有一定的劣势。羟基磷灰石材料虽然具有良好的生物相容性，并且能提供一定的支撑作用，但是生物降解速率很慢，降解速率不及自体骨的生长速率。磷酸三钙材料的生物降解显著，可能导致人体骨还没有完全愈合的情况下磷酸钙已降解完全 [7]。当羟基磷灰石或磷酸三钙独立使用，不能满足促进骨再生的要求，需要将其通过物理或化学的手段复合在一起，综合各自组分的优点，通过调节各组分的比例，达到控制复合材料降解速率的目的 [8-10]。

目前，关于磷酸钙材料的研究均专注于磷酸钙材料的结构组成、理化性能、生物学性能等指标，对于磷酸钙材料的降解速率、降解机理等未进行深入研究，而且也没有形成统一规范的评价方法 [11,12]。国际标准化组织（ISO）和我国的标准化机构均未推出关于磷酸钙材料溶解性测试与评价相关标准。本文研究的主要目的是使用电感耦合等离子体质谱法测试复合磷酸钙颗粒在TRIS缓冲溶液溶解的Ca2+浓度，分析Ca2+离子浓度随浸泡时间变化的规律，探讨形成这种变化规律的原因。