不同利用年限水稻土氨氧化细菌群落结构变化研究

赵伟烨,刘 玮,刘 勤,蒋先军*

(1.西南大学资源环境学院，重庆 400715；2.中国科学院土壤研究所，江苏 南京 210008)

不同利用年限水稻土氨氧化细菌群落结构变化研究

赵伟烨1,刘 玮1,刘 勤2,蒋先军1*

(1.西南大学资源环境学院，重庆 400715；2.中国科学院土壤研究所，江苏 南京 210008)

【目的】本文以利用年限分别为100、300、700、1000和2000年的水稻土及杭州湾海涂(0年)作为研究对象，探究对不同利用年限水稻土氨氧化细菌群落结构随着利用年限的变化而显著变化。【方法】采用PCR-DGGE技术分析6个利用年限水稻土的氨氧化细菌群落组成。【结果】利用PCR-DGGE得到的电泳图像显示不同利用年限水稻土样品可检测到的AOB的DGGE条带数量均存在明显差异。【结论】不同利用年限对水稻土氨氧化细菌群落结构产生较大的影响。

利用年限；水稻土；氨氧化细菌；群落结构

在水稻种植过程中，稻田土壤都会经历多个干湿交替循环[5]，这为土壤微生物提供了独特的生存环境。土壤微生物是使土壤具有生命力的最主要成分，在土壤形成和发育过程中起主要作用，是评价土壤质量和肥力的一个重要指标[6]。利用年限对微生物的各项生理指标均会产生深刻影响。【前人研究进展】胡君利等对水稻土的研究结果发现，随着利用年限的延长，水稻土微生物生物量碳、氮，基础呼吸，过氧化氢酶，转化酶等均有不同程度的下降[7]，硝化作用强度和产甲烷等也趋向降低[8]。长期固定的耕作模式定向改变着土壤中微生物区系和微生物生物量。Caldwell等(1999)研究发现，森林生态系统转变成农田生态系统会导致土壤退化[9]，土壤微生物生物量在土壤开发利用后快速下降，并会随着农业耕种而降低[10]。在达到一定利用年限后，土壤微生物生物量的变化幅度明显减少，即微生物群落大小达到一个相对稳定的状态[11]。另外，利用年限也会影响土壤中微生物群落的演替。浙江慈溪旱作农田土壤在整个旱作过程中，微生物生物量C/N始终随年限延长而显著升高[12]，这说明土壤中微生物群落结构一直对利用年限的延长而变化。对浙江慈溪水稻土研究发现，水稻土在持续耕作之后，微生物群落的碳源利用特性发生了改变，微生物功能多样性得到了一定的加强。但是一些调控温室气体排放的微生物过程如呼吸作用明显下降，硝化作用和产甲烷势等均趋于减弱[13]。

【本研究切入点】众多研究表明，不同植被条件下，利用年限的长短均会不同程度地影响土壤的理化性质和生物学性质，这对于认识农业开发的生态效应以及土地的可持续利用具有重要意义。【拟解决的关键问题】本试验以采自浙江慈溪的不同利用年限水稻土为研究对象，探究不同利用年限对氨氧化细菌群落结构的影响，为解释农业土壤的环境质量演变规律和可持续利用机理提供基础依据，并进一步指导具体农业生产，保护和引导土壤向高肥力和可持续方向发展。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

浙江慈溪位于杭州湾南岸，介于北纬30°02′～30°24′和东经121°02′～121°24′，海拔2.6～5.7 m。处于亚热带南缘，属亚热带季风气候，年气温在-9.3～38.5 ℃，平均气温为16.3 ℃，无霜期246 d。年均降水量为1325.0 mm，平均日照为1933.5 h，平均风速为2.7 m/s。土壤矿物主要为伊利石，高岭石和蒙脱石。据慈溪水利志记载，现慈溪市境在6000多年前尚为浅海区，由江河输入大海的陆地泥沙逐渐沉积堆高形成海涂，存在生物活动和有机质、氮素等的积累，具有一定生产力。公元5世纪起，当地人民开始围涂开垦，并随着海涂淤积的北移不断增筑海塘，至今大部分地段已筑有十塘，建筑面积约有775 km2，按建筑年代大致可分为3片：南片——南境沿山北麓至大古塘以南，自公元5世纪开始成陆至公元10世纪(元代至正年间)，成陆历时1500年；中片——大古塘以北至七塘，为11世纪至20世纪初所围；北片——七塘至十塘，为20世纪中后叶围成。由于各海塘修筑时间均有明确记载，现可根据海塘建筑年代来推算各海塘间水稻土的利用年限。

2015年11月依据海塘建筑年代核定各海塘间水稻土的利用年限，并采集在利用年限上具有明显差距(50～2000年)的水稻土耕作样品，0年土壤采样点位于杭州湾滩涂，北纬30°19.5′，东经121°8.82′；100年土壤采样点位于慈溪市桥头镇小桥头村车头片，北纬30°09.2′，东经121°20.3′；300年土壤采样点位于慈溪市三北镇公山村，北纬30°06.2′，东经121°30.6′；700年土壤采样点位于慈溪市周巷镇大古塘村，北纬30°10.1′，东经121°09.1′；1000年土壤采样点位于慈溪市周巷镇南周巷村，北纬30°09.5′，东经121°06.9′；2000年土壤采样点位于慈溪市掌起镇任住溪村，北纬30°05.6′，东经121°26.3′；采集的土样于4 ℃冷存。土壤采集时各样点稻田均处于落干状态。所有土样均发育于同一母质(潮汐土壤)，其生态环境也一致。

1.2 采集与处理样品

1.3 分析方法

1.3.1 土壤氨氧化细菌amoA功能基因定量分析 土壤微生物总DNA提取。采用FastDNA SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals,LLC)试剂盒和FastPrep 24 bead-beating instrument (Qbiogene,Inc.)细胞裂解仪提取土壤总DNA。称取0.50 g土壤样品，按试剂盒操作说明的实验步骤进行土壤微生物总DNA的提取，DNA样品保存于-20 ℃待用。

amoA功能基因实时荧光定量PCR分析。参照He等(2007)报道的方法[14]，可得到氨氧化细菌分子标靶基因的重组质粒，测定质粒浓度，结合质粒的分子质量，计算得出氨氧化细菌的原始拷贝数为1.25×1023μl-1。以10倍梯度稀释氨氧化细菌的质粒，通过荧光实时定量PCR获得氨氧化细菌的标准曲线，每个样品3次重复。

采用大连宝生物工程有限公司的SYBR Premix ExTaqTM Perfect Real Time试剂盒与CFX96 Real-Time PCR System 扩增仪上进行。氨氧化细菌的定量PCR分析的分子标靶基因的引物序列为amoA-1F(GGGGTTTTCTAGGTGGT)及amoA-2R(CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC)，反应条件为95℃,5.0 min;35个循环均为：95 ℃,30 s; 57 ℃,45 s; 72 ℃,1 min,85 ℃,5 s with plate read; Melt curve 65.0～95.0 ℃,increment 0.5 ℃,0:05+ ；PCR分析的分子标靶基因的引物序列为amoA-1F-GC(CGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCGGGGTTTCTACTGGTGGT)及amoA-2R(CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC)，反应条件为95 ℃,5.0 min; 35个循环(95 ℃,30 s; 57 ℃,45 s; 72 ℃,1 min,85 ℃,5 s); Melt curve 65.0 ℃ to 95.0℃,increment 0.5 ℃,0:05+ plate read。反应体系为20 μl，包括1 μl DNA模板、10 μl SYBR Premix ExTaqTM Perfect Real Time，前、后引物各0.05 μl(20 (mol·L-1)和8.9 (l的灭菌双蒸水。实验对照用灭菌双蒸水代替DNA作为反应模板。

1.3.2 氨氧化细菌amoA基因的PCR-DGGE分析 采用PCR-DGGE实验对氨氧化细菌的amoA基因进行扩增，以反映在不同利用年限水稻土中氨氧化细菌的多样性。PCR扩增引物分别采用amoA-1F-GC和amoA-2R。PCR扩增过程在PCR热循环仪(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)上进行，PCR反应体系为20 μl，包括1 μl DNA模板、10 μl premix绿酶，前、后引物各0.05 μl(20 μmol·L-1)和8.9 μl的灭菌双蒸水。扩增结束后，用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳验证细菌的amoA基因是否得到特异性扩增产物。氨氧化细菌对的DGGE分析采用8 %(质量/体积)的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为45 %～65 %。土壤样品每个重复取150～200 ng PCR产物加样到按上述方法配制的聚丙烯酰胺凝胶中，在电泳槽中进行电泳，采用0.5×Tris-acetate-EDTA缓冲液，温度60 ℃，70 V电压条件下电泳16 h。凝胶取出后用SYBR Green Ⅰ染料染色30 min，用分子成像器FX(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)扫描成像。DGGE图像用Quantity One软件进行分析。

1.4 数据处理

DGGE图像处理采用Quantity One软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 不同利用年限水稻土氨氧化细菌数量变化

土壤中发生的硝化作用是典型的生物学过程，其发生与速率主要受氨氧化微生物的丰度和活性制约[15]。已有研究表明AOB可能在水稻土中氨氧化过程中起主导作用[4]。研究不同年限水稻土中氨氧化细菌有一定意义。从表1来看，对氨氧化细菌来说，0、100、300年水稻土中细菌数量呈现显著增长趋势，1000和2000年水稻土氨氧化细菌丰度与300年水稻土基本处于相同水平，而700年土壤氨氧化细菌含量显著低于其他年限土壤(P<0.05)。

2.2 不同利用年限水稻土氨氧化细菌的群落结构多样性分析

利用氨氧化细菌的特异引物amoA-1F，amoA-2R对提取出来的土壤微生物总DNA进行PCR扩增，将扩增出来的PCR产物在变性梯度为45 %～65 %的凝胶中进行电泳，得到不同利用年限水稻土氨氧化细菌群落组成的DGGE图谱(图1)。

利用Quantity One软件(Bio-red)对DGGE图谱条带进行数字化处理分析，结果显示不同利用年限水稻土样品可检测到的DGGE条带数量存在明显差异，水稻土中氨氧化细菌的群落结构随利用年限发生显著变化。利用年限为300、700年的水稻土中可以检测到的DGGE条带数量都较高，在12条左右；而利用年限为0、100、1000和2000年的水稻土中可以检测到的条带数量低于9条。说明年限为300、700年的水稻土中氨氧化细菌的群落结构多样性要比利用年限为0、100、1000和2000年的水稻土中氨氧化细菌的群落结构多样性好，氨氧化细菌的群落结构多样性随着利用年限的增加呈现出先曾加后降低的趋势。

表1 不同利用年限水稻土氨氧化细菌数量Table 1 The number of ammonia oxidizing bacteria with different utilization years in paddy soil

注：小写字母为同行相比，字母不同表示差异达到P<0.05显著水平。

图1 不同利用年限水稻土氨氧化细菌的PCR-DGGE图谱Fig.1 PCR-DGGE mapping of ammonia oxidizing bacteria with different utilization years in paddy soil

2.3 不同利用年限水稻土氨氧化细菌的群落结构聚类分析

对DGGE图谱进行聚类分析结果，如图2所示。首先利用年限为0年的水稻土中氨氧化细菌群落结构组成与100、300、700、1000、2000年的水稻土中氨氧化细菌群落结构组成相似度约为26 %，明显不同于其他利用年限水稻土中氨氧化细菌群落结构组成，故单独归为一类，说明人工耕作明显影响了氨氧化细菌的群落结构组成。氨氧化细菌群落结构组成相似性最高的是100和700年的水稻土，相似度接近70 %；其次是1000和2000年的水稻土中氨氧化细菌群落结构组成，相似度约为63 %。100和700年与1000和2000年这2组的相似度也达到50 %左右，故将这4个利用年限水稻土中氨氧化细菌群落结构组成聚为一类。然后在与300年处理聚类相似度约为44 %。这也与DGGE图谱可检测条带数量差异的结果一致。

相似性越大，表明氨氧化细菌群落结构组成越接近，差异越小。各利用年限水稻土中氨氧化细菌群落结构组成的相似性不高，说明不同利用年限水稻土中氨氧化细菌群落结构组成差异性较大。表明人工耕作会对氨氧化细菌群落结构组成造成影响，但影响效果并不是随着利用年限的增加而增大，而是呈现出不规则的变化。

3 结 论

通过对土壤样品中氨氧化细菌DNA的提取以及PCR-DGGE分析的结果表明，不同利用年限对水稻土氨氧化细菌群落结构产生较大的影响。

图2 不同利用年限水稻土氨氧化细菌的PCR-DGGE图谱的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of PCR-DGGE spectra of ammonia oxidizing bacteria with different utilization years in paddy soils

(1)不同利用年限水稻土中氨氧化细菌群落结构多样性表现出随着利用年限的增加先增加后降低的趋势。

(2)不同利用年限水稻土中氨氧化细菌群落结构组成相似性不高，差异性较大。

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ComparisonofAmmoniaOxidationBacteriaCommunityStructureinPaddySoilwithDifferentUtilizedYears

ZHAO Wei-ye1,LIU Wei1,LIU Qin2,JIANG Xian-jun1*

(1.School of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400716,China;2.Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Jiangsu Nanjing 210008,China)

【Objective】In the present paper,paddy soil and tideland soil of Hangzhou Bay were taken as target soil to gain a understand of how the utilized years affected the ammonia oxidation bacteria community structure,in which the former has been used to plant rice for about 100,300,700,1000,2000 years and the latter has never been used to plant crops (0 year).【Method】PCR-DGGE technology was adopted to analyze the ammonia oxidation bacteria community structure of 6 soil samples with different utilized years.【Result】The AOB and DGGE strips showed a significant different pattern in electrophoretic images attained from PCR-DGGE analyzing.【Conclusion】Differences in utilized years can greatly affect the ammonia oxidation bacteria community structure in paddy soil.

Utilized years; Paddy soil; Ammonia oxidation bacteria; Community structure

1001-4829(2017)4-0784-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.013

2016-04-08

水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07104-003)

赵伟烨(1991-)，男，山东滨州人，硕士研究生，主要从事土壤肥力与生态研究，E-mail:zhaowy666@163.com，Tel：15736032323，*为通讯作者，E-mail: jiangxj@swu.edu.cn。

S154.37

A

(责任编辑 李 洁)