猪流行性腹泻病毒RT-LAMP方法的建立及应用

田 野 ，张祥斌 ， 宋延华 ， 张常明 ， 潘永飞 ， 刘佳佳 ， 贺东生

(1. 广东温氏食品集团股份有限公司 ， 广东 云浮 527439 ； 2. 华南农业大学兽医学院 ， 广东 广州 510642)

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP方法的建立及应用

田 野1，张祥斌1， 宋延华1， 张常明1， 潘永飞1， 刘佳佳1， 贺东生2

(1. 广东温氏食品集团股份有限公司 ， 广东 云浮 527439 ； 2. 华南农业大学兽医学院 ， 广东 广州 510642)

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。我国从1976年开始陆续有PED的报道,20世纪80年代后该病在中国流行面逐渐扩大,并多与猪传染性胃肠炎、轮状病毒等其他肠道病原混合感染,给养猪业造成严重经济损失[1]。

环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术依赖6条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶[2-3]，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列。逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)是在原反应液中加入一定量的逆转录酶，可以实现RNA的一步扩增。本实验室利用建立起RT-LAMP技术，可以为更好地防控和研究该病毒的提供检测方法。

1 材料与方法

1.1 毒株、病料和试剂 猪流行性腹泻病毒(PEDV，GDGZ株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV,JX株)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV,GD株)、猪细小病病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)等毒株均由本实验保存。BstDNA聚合酶为New England BioLabs公司产品；甜菜碱(Betaine)为Sigma公司产品。

1.2 病毒核酸的提取 猪细小病病毒和伪狂犬病病毒等DNA病毒的核酸用TaKaRa DNA提取试剂盒提取。猪流行性腹泻病毒、蓝耳病病毒和传染性胃肠炎病毒等RNA病毒的核酸用TRIZol方法提取。

1.3 猪流行性腹泻病毒LAMP引物的设计 在GenBank获取20株猪流行性腹泻病毒的序列，通过对比发现M基因是该病毒保守性和特异性较好序列。将M基因序列导入LAMP引物设计软件Primer design V3(http：//primerexplorer.jp/elamp 3.0.0/index.html)，设计出了猪流行性腹泻病毒LAMP引物，表1。

1.4 猪流行性腹泻RT-LAMP检测方法的建立 RT-LAMP基本的反应体系为25 μL：1×Thermopol 缓冲液，8 mmol/L Mg2+，1 mmol/L甜菜碱，1.4 mmol/L dNTPs,0.2 μmol/L外引物(F3和B3)，1.6 μmol/L内引物(FIP和BIP)，0.8 μmol/L 环引物(LF和LB)，2 μL模版RNA，1U AMV逆转录酶，8 U Bst DNA聚合酶，20 μL石蜡封闭液。

在LAMP基本反映体系基础上设置不同引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度，以及不同反应时间(15、25、35、45、55、65 min)和反应温度(57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃)，获得最佳反应参数，建立猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测体系。

1.5 猪流行性腹泻病毒RT-LAMP特异性和稳定性 把PRRSV、TGEV、PPV、PRV等病毒的核酸为模板，按上述RT-LAMP体系进行检测，分析其特异性。将PEDV的阳性病料为模板进行4次RT-LAMP，分析该方法的稳定性。

1.6 猪流行性腹泻病的RT-LAMP方法敏感性和稳定性 以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释的猪流行性腹泻病毒核酸为模板分别进行RT-LAMP和RT-PCR，分析其敏感性。

1.7 PEDV一步法RT-LAMP方法的临床应用 应用建立的RT-LAMP方法对实验室送检的40份仔猪腹泻病料进行检测，同时使用常规RT-PCR方法和胶体金试剂盒进行检测并比较试验结果。

2 结果

2.1 猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立 研究各个因素对RT-LAMP的影响，获得最佳反应参数(8 mmol/L Mg2+，1 mmol/L甜菜碱，1.4 mmol/L dNTPs,0.2 μmol/L外引物，1.6 μmol/L内引物，59 ℃，55 min)，结果见图1，图2。

表1 猪流行性腹泻病毒LAMP引物

图1 不同反应温度LAMP结果

图2 不同反应时间LAMP结果

2.2 猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的特异性和稳定性 以PPV、PRV、PRRSV、TGEV等病毒的核酸检测RT-LAMP的特异性，如图3.由图3可知，猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法只能扩增PEDV的核酸，不能扩增其他病毒的核酸，故该检测方法具有良好的特异性。用该方法检测4个阳性病料，均出现目的条带，说明该方法具有稳定性。

2.3 猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的敏感性 以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释的猪流行性腹泻病毒核酸为模板分别进行RT-LAMP和RT-PCR，结果如图4。由图4可知，RT-LAMP可以检测到10-3稀释的PEDV的核酸，比普通的RT-PCR灵敏性高100倍。

图3 PEDV RT-LAMP方法的特异性和稳定性

图4 猪流行性腹泻病毒RT-LAMP和RT-PCR敏感性对比图

2.4 PEDV一步法RT-LAMP方法临床试验结果 应用建立的RT-LAMP方法对本实验室保存的40份仔猪腹泻样品进行检测，同时使用常规RT-PCR方法和胶体金试剂盒对该病料进行检测，结果显示,RT-LAMP方法检出12份阳性病料，检出率为30%，RT-PCR方法检出5份阳性病料，检出率为12.5%，胶体金试剂盒检出4份阳性病料，检出率为10%(表2)，说明本试验建立的RT-LAMP方法更为敏感，特异性更高。

表2 3种检测方法临床检测结果

3 讨论

近几年来仔猪腹泻，特别是有PEDV引起的病毒性腹泻给养猪业造成巨大的经济损失，用现有的疫苗对该病进行防控结果总是差，所以尽早发现隔离病猪可能是当下比较行之有效的防控思路。故建立一个特异性高、敏感性强，且适于猪场的检测方法成了当务之急。本实验室针对PEDV的M基因设计引物建立的RT-LAMP方法正好符合这种要求，通过检测40份疑似病料，RT-LAMP的阳性检出率30%要比胶体金试剂盒检测(10%)和PCR(12.5%)高。而且该技术的最大优点就是无需精密的仪器，操作简单快捷，因此适合中小型猪场对病原的快速诊断。

[1] 倪艳秀,林继煌,何孔旺,等. 猪流行性腹泻研究概况[J]. 畜牧与兽医, 2001, 33(1): 38-40.

[2] Notomi T,Okayama H, Masubuchi H,etal. Loopmediated isothermal amplification of DNA [J]. Nucl Acids Res, 2000,28(12)：63-68.

[3] 肖斌，朱永红，邹全明．简单敏感的环介导等温扩增基因诊断新技术[J]．中华检验医学杂志，2005，28(7)：761-763.

S858.28

B

0529-6005(2017)08-0038-02

2016-07-29

吉林省经济菌物创新平台(2014—2016)

田野(1988-)，男，硕士生，研究方向为临床兽医学，E-mail：709756456@qq.com

贺东生，E-mail：dhe@scau.edu.cn