HCLP法测定中药泡腾栓组分含量的研究

赵树臣 ， 潘秋亮 ， 刘克祥 ， 侯振中

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

HCLP法测定中药泡腾栓组分含量的研究

赵树臣 ， 潘秋亮 ， 刘克祥 ， 侯振中

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江 哈尔滨 150030)

在前期采用正交法筛选出具有清热解毒抑菌、去腐生肌的中药组方泡腾栓的基础上，采用HCLP法测定该中药泡腾栓中主要成分绿原酸和黄芩苷的含量，以此评价其质量，更高效地治疗奶牛子宫内膜炎。结果显示，绿原酸在波长 349 nm 下和黄芩苷在270 nm下，标准品分别在5.144 min和6.823 min出现明显的色谱峰，而阴性对照无峰出现。绿原酸和黄芩苷的标准曲线分别为A=10068C-2351.1，R=0.9995；A=20919C-132936，R=0.9999；精密度和重现性均良好；加样回收率分别为99.46±0.93和99.23±0.64；每粒栓剂中绿原酸和黄芩苷含量分别为2.91±0.031 mg和13.48±0.113 mg。表明建立起来的HPLC条件可以对该中药泡腾栓组分进行含量分析，并可评价其质量，为治疗奶牛子宫内膜炎中药栓剂的研发和生产提供质量检测保证。

HCLP ； 中药泡腾栓 ； 奶牛 ； 子宫内膜炎

子宫内膜炎是造成奶牛不孕症的主要原因之一。中药具有副作用小、残留少和不易产生耐药性等优点,治疗奶牛子宫内膜炎多以活血化瘀、清热解毒、抑菌消炎为原则[1]。将筛选出的中药组方制备成泡腾栓剂，通过子宫给药，通过泡腾剂作用下产生大量的泡沫，将中药成分带入到子宫黏膜皱褶，从而更大程度发挥药物的作用，以达到更好的治疗效果[2]。此项研究的目的是采用HCLP法测定已筛选研发的中药组方泡腾栓中主要成分的含量，评价制备过程各主要成分的有效性和质量，为中药栓剂治疗奶牛子宫内膜炎的研发和生产提供参考依据。

1 材料

1.1 主要仪器 高效液相色谱仪；二极管紫外检测器；电子分析天平等。

1.2 主要试剂 柠檬酸、碳酸氢钠、聚乙二醇(PEG)-6000、吐温-80等均为分析纯，甲醇、冰醋酸，为色谱纯；蒲公英、当归、川芎等中药提取物颗粒。

2 方法

2.1 标准品溶液的配制 精确称取绿原酸标准品10.0 mg，用50%甲醇溶液定容配制400 μg/mL的储备液和不同浓度的标准品溶液，备用；精确称取黄芩苷标准品10.4 mg，用50%(v/v)甲醇溶液定容配制416 μg/mL的储备液和不同浓度的标准品溶液，备用。

2.2 供试品溶液的配制 取制备的中药泡腾栓10粒，研细，精确称取2 g，置于100 mL容量瓶中，加入适量50%甲醇溶液，超声处理30 min，用50%甲醇溶液定容，离心，取上清液，有机微孔滤膜(0.22 μm)过滤，得到绿原酸的供试品溶液，备用；同样方法处理得到黄芩苷的供试品溶液，备用。

2.3 色谱条件 色谱柱为Hyper sil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；绿原酸流动相为甲醇-1%冰醋酸(30∶70)，检测波长为349 nm；黄芩苷流动相为甲醇-1%冰醋酸(50∶50)；检测波长为 270 nm，流速均为1 mL/min，进样量均为10 μL，柱温均为25 ℃。

2.4 阴性对照试验 按处方分别称取不含双花和蒲公英以及不含黄芩的其他药材，依照处方加工工艺制备成泡腾栓，然后按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液，按照上述测定条件进行试验。

2.5 阳性对照试验 根据栓剂组方配比，用双花、蒲公英和黄芩的中药提取物颗粒按照供试液的方法制备成绿原酸阳性和黄芩苷阳性对照溶液，按照上述测定条件进行试验。

2.6 标准曲线的绘制 精确吸取不同浓度的绿原酸标准品溶液和黄芩苷标准品溶液，按上述测定条件分别测定两种标准品，并记录色谱图及色谱峰面积A，并进行色谱分析，用峰面积A为纵坐标，以对照品质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线。

2.7 精密度试验 按上述色谱条件，分别吸取绿原酸和黄芩苷对照品溶液10 μL进样，重复进样5次，以绿原酸和黄芩苷的的峰面积计算相对标准偏差(RSD)。

2.8 重现性试验 定量称取5份中药泡腾栓粉末，溶解，定容，按照配制绿原酸供试液和黄芩苷供试液的方法处理，进行HPLC测定，每次进样10 μL，分别计算峰面积的RSD。

2.9 样品含量测定 精确称取中药泡腾栓粉末，按上述方法分别测定10个绿原酸和黄芩苷供试品溶液，每次进样10 μL，记录峰面积，分别计算中药泡腾栓中绿原酸和黄芩苷的含量。

2.10 加样回收率试验 精密吸取已知含量的绿原酸供试品和黄芩苷供试品各4份，分别对应加入一定质量的绿原酸对照品溶液和黄芩苷对照品溶液，按上述条件分别测定，按下列公式计算回收率。

3 结果

3.1 绿原酸和黄芩苷色谱图 根据图1～图4显示，在此条件下，绿原酸标准对照品在5.144 min处有明显的色谱峰，绿原酸供试液在5.132 min处出现明显色谱峰，而在此刻附近阴性对照品溶液几乎无峰出现。表明绿原酸的阴性对照对其测定基本无干扰，绿原酸阳性对照在5.167 min处出现相似峰形。

图1 绿原酸标准对照品高效液相色谱图

图2 绿原酸阴性对照品高效液相色谱图

图3 绿原酸阳性对照高效液相色谱图

图4 绿原酸供试品高效液相色谱图

图5 绿原酸标准对照品高效液相色谱图

图6 黄芩苷阴性对照品高效液相色谱图

图7 黄芩苷阳性对照高效液相色谱图

图8 黄芩苷供试品高效液相色谱

根据图5～图8显示，在此条件下，黄芩苷标准对照品在6.823 min出现明显的色谱峰，黄芩苷供试液在6.678 min处出现了相同峰形，黄芩苷阳性对照在6.788 min处出现了相同峰形，而此刻附近阴性对照基本无峰出现，表明黄芩苷的阴性对照对其测定无干扰。

3.2 标准曲线的绘制 用峰面积A对浓度C进行回归处理，得到绿原酸和黄芩苷标准溶液的线性回归方程分别为：A=10068C-2351.1，R=0.999 5；A=20919C-132936，R=0.999 9，标准曲线见图9和图10。结果表明，绿原酸和黄芩苷分别在3.2～25.6 μg/mL和20.8～62.4 μg/mL范围内线性关系良好。

图9 绿原酸的标准曲线

图10 黄芩苷的标准曲线

3.3 精密度测试结果 绿原酸精密度试验结果显示，绿原酸峰面积的RSD为0.85%，表明精密度良好；黄芩苷精密度试验结果显示，黄芩苷峰面积的RSD为0.47%，表明精密度良好。

3.4 重现性试验结果 绿原酸重现性试验结果显示，绿原酸峰面积的RSD为1.36%，表明绿原酸重现性良好；黄芩苷重现性试验结果显示，黄芩苷峰面积的RSD为0.86%，表明黄芩苷重现性良好。

3.5 加样回收率试验结果 标准品中加入1.60 mg绿原酸，测得回收率为99.46±0.93；加入黄芩苷2.08 mg，黄芩苷的平均加样回收率为99.23±0.64。

3.6 样品含量测定结果 中药泡腾栓均为重量差异合格，平均栓重2.183 g/粒，每粒栓剂中绿原酸含量为2.91±0.031 mg；每粒栓剂中黄芩苷的含量为13.48±0.113 mg。

4 讨论

中草药治疗奶牛子宫内膜炎具有很大优势，而泡腾栓剂则能在泡腾栓崩解过程中将药物带入到子宫黏膜皱褶，从而更大程度地发挥药物的作用，以此得到更好的治疗效果。此研究是在前期以中药的抑菌为前提，经正交法筛选泡腾栓基质最佳配比并制备成中药泡腾栓剂的基础上进行的后续研究[3]。HCLP具有分辨率高，重现性好，常用于药品的质量控制、中药的成分研究等方面[4]。

试验采用HPLC法对中药泡腾栓剂中的双花、蒲公英的主要有效成分绿原酸，以及黄芩的主要有效成分黄芩苷进行定量分析。经全波长扫描，发现绿原酸的最大吸收波长为349 nm，黄芩苷的最大吸收波长为270 nm，和中国药典(2010版)[5]“金银花”中的绿原酸的检测波长327 nm，黄芩苷的检测波长280 nm有所差异，但是也符合测定范围，故选择全波长扫描结果为后期测定的最佳波长。在绿原酸含量的测定中，流动相甲醇：1%冰醋酸为30∶70时杂峰基本无干扰；在黄芩苷含量的测定中，流动相甲醇：1%冰醋酸比例为50∶50时为最佳。在本试验中建立的色谱条件下，绿原酸和黄芩苷标准品分别在5.144 min和6.823 min出现明显的色谱峰，而供试液和阳性对照在相近位置出现相同峰形，但阴性对照无峰出现，表明阴性对照对其测定无干扰。在本试验中建立的色谱条件下，绿原酸和黄芩苷的标准曲线的线性关系、精密度和重现性均良好；通过阴性对照试验、回收率试验结果显示建立起来的HPLC条件可以对该中药泡腾栓组分进行定量分析。

本试验采用HCLP法测定筛选的中药组方泡腾栓与同样的中药组方中主要成分的含量，评价制备中药泡腾栓剂主要成分在制作过程的有效性，以及评价中药泡腾栓的质量，为治疗奶牛子宫内膜炎中药栓剂的研发和生产提供参考依据。

[1] 王洪海，王国卿，郭梦尧，等.中草药治疗奶牛子宫内膜炎研究进展[J].中国兽医杂志，2010，46(8)：64-66.

[2] 赵树臣，李佳刘景辉，等．治疗奶牛子宫内膜炎溶菌酶泡腾栓的制备[J]．中国兽医杂志，2010，46(5)：69-71．

[3] 潘秋亮， 赵树臣， 侯振中.治疗奶牛子宫内膜炎中药泡腾栓的筛选及研制[J]，中国兽医杂志，2016，52(6)：111-114.

[4] 费扬，赵亮，张海，等．高效液相色谱法测定抗菌消炎片中绿原酸、黄芩苷、黄芩素和大黄酚的含量[J]．第二军医大学学报，2009，10：1191-1194．

[5] 国家药典委员会．中华人民共和国药典[M]．2010版二部．

R283

B

0529-6005(2017)08-0094-03

2016-11-15

黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(GZ13B005)；东北农业大学动物普通疾病防治重点实验室开放课题

赵树臣(1976-)，男，副教授，博士，主要从事动物生殖内分泌和生殖毒理学研究，E-mail：zscrichard@163.com