食源性单增李斯特菌LPXTG蛋白基因的检测

丁 剑 ， 马 勋 ， 陈 朔 ， 曹树珠 ， 王贝贝 ， 杜冬冬 ， 张奇文

(石河子大学动物科技学院 ， 新疆 石河子 832000)

食源性单增李斯特菌LPXTG蛋白基因的检测

丁 剑 ， 马 勋 ， 陈 朔 ， 曹树珠 ， 王贝贝 ， 杜冬冬 ， 张奇文

(石河子大学动物科技学院 ， 新疆 石河子 832000)

单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)作为四大重要食源性病原菌之一，对人类及多种畜禽健康威胁极大。LM细胞胞壁表面分布多种毒力蛋白，在感染机体过程中发挥重要作用，其中有一类至关重要的表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG，分选酶A能够识别基序LPXTG，共价结合到肽聚糖上，呈现在细胞表面发挥毒力作用。本试验以不同食品中分离得到的24株单增李斯特菌为试验对象，设计合成了41对预测含LPXTG基序表面蛋白的引物，利用PCR技术进行扩增，凝胶电泳成像系统检测扩增产物片段大小，计算24株食品源单增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的携带。结果表明，不同LM分离株LPXTG蛋白基因的携带率不同：其中仅有12.5%(3/24)的分离株携带率在85%以上；不同LPXTG蛋白基因的检出率不同，在41个检测对象中，有8个基因的检出率100%，有3个基因的检出率不足20%，Lmo1115基因在所有分离株中均未检测到。本研究对了解食品源LM分离株的LPXTG蛋白基因的分布以及探明食品源LM的致病性具有重要意义。

单核细胞增多性李斯特菌 ； LPXTG基序表面蛋白 ； PCR

单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是一种胞内寄生的革兰阳性菌，重要的食源性人兽共患病原菌之一[1]，可引起人和多种动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产等[2]。该菌在 4 ℃的环境中仍可生长繁殖，可以通过污染奶及奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等食物导致人群感染，是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一[3]。该菌分布范围极广，环境耐受性较强。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每100万人2～15例，死亡率为20%～30%[4]，给人及动物的健康带来严重的危害。

在LM细胞胞壁的表面分布着多种发挥重要作用的表面蛋白，这些蛋白在感染机体和适应环境的过程中发挥着重要作用。其中有一类至关重要的表面蛋白，其前体蛋白C端含有保守基序LPXTG，目前研究表明，这类蛋白由分选酶SrtA通过识别 LPXTG保守基序，将蛋白共价结合到细胞壁肽聚糖上，呈现在细胞表面发挥重要毒力作用。 本研究以不同食品中分离得到的24株单增李斯特菌为试验对象，设计合成了41对预测含LPXTG基序表面蛋白的引物，利用PCR技术进行扩增，凝胶电泳成像系统检测扩增产物片段大小，计算24株食品源单增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的携带率。

1 材料与方法

1.1 菌株 24株食品源单增李斯特菌均分离自新疆各师局2014-2015年送检的食品。其中LM6072小、LM6072大和LM6008分离自熟肉制品；LM2947和LM2956分离自调理鸡柳；LM5470、LM5563、LM5570、LM5567、LM5573、LM3103-1、LM5474、LM3189、LM3197和LM3195分离自调理肉制品；LM3251、LM2941、LM4786、LM4788、LM502、LM2935和LM502-2分离自调理肉制品冷冻鱼糜制品；LM461和LM472分离自外卖配送的盒饭。

1.2 引物 部分引物设计参照Mariscotti J F等[5]所提供的，具体如下(表1)。

1.3 主要试剂与仪器 PCR Mix、ddH2O、DL-2 000 DNA Marker，均购自广州东盛生物科技有限公司；脑心浸液培养基(BHI)，购自青岛高科技园海博生物技术有限公司；PCR仪(Bio-Rad MyCycler thermal)；电泳系统和凝胶成像系统(BIO-RAD-2000，美国)。

2 方法

2.1 菌种活化 将菌株从-80 ℃保存的甘油管接种于BHI平板，37 ℃培养24 h。

2.2 PCR反应体系和参数 PCR扩增体系：菌液2 μL；上下游引物各1 μL；2×PCR Mix 10 μL，然后加ddH2O至体积20 μL。

PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR扩增产物的电泳：琼脂糖凝胶加EB染色后电泳，将PCR扩增产物及2 000 Marker，上样10 μL；电压110 V，电流60 mA，20 min后观察电泳结果，并对其进行分析。

3 结果

PCR扩增后经1.5%琼脂糖凝胶在TBE电泳缓冲液中进行电泳，与DS 2000相比，目的片段均与所有预期片段一致。

不同LPXTG蛋白基因的检出率也不同，在检测的基因中有inlA、inlJ、Lmo1413、inlH、Lmo0331、Lmo0610、Lmo1799、Lmo2085的检出率为100%。lmo0801、Lmo0435，Lmo2026的检出率不到20%。而Lmo1115蛋白在所有分离株中均未检测到(表1)。

不同LM分离株LPXTG蛋白基因的携带率不同。携带率最高为95.1%(39/41)，携带率最低为56.1%(23/41)；携带率在85%以上的分离株有3株，均为调理肉制品分离株；携带率在76%～85%之间的分离株有9株，其中4株是调理肉制品分离株，4株是冷冻鱼糜分离株，1株是调理鸡翅分离株；携带率在66%～75%之间的分离株有3株，分属熟肉制品、调理鸡柳和冷冻鱼糜制品；携带率在65%以下的分离株有9株，其中3株调理肉制品分离株，2株是冷冻鱼糜分离株，2株是熟肉制品分离株和2株盒饭分离株(表2)。

4 讨论

单增李斯特菌的表面蛋白比其他G+菌的表面蛋白都要丰富。当表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG，分选酶A能够识别基序LPXTG，共价结合到肽聚糖上，呈现在细胞表面发挥毒力作用。根据EDG-e株全基因组序列，发现41个带有LPXTG基序的单增李斯特菌蛋白，其中19个蛋白同时具有LRR区[6]。研究比较清楚的有Lmo0262(InlG)、Lmo0263(InlH)、Lmo0433(InlA)、InlJ、Lmo0327、Lmo0610、Lmo0842和Lmo1413等，研究结果表明，这些表面蛋白与毒力有关[7-9]。

24株食品源LM分离株LPXTG蛋白基因的携带率不同。其中调理肉制品分离株的携带率普遍较高，而熟肉制品和盒饭分离株的携带率普遍偏低，这是否与食品加工环节温度有关，另外不同LPXTG蛋白基因的检出率也不同，这与菌株的致病性是否密切相关都需要进一步的研究。

表1 41个LPXTG基序表面蛋白引物序列及检出率

表2 24株食品源单增李斯特菌LPXTG基序蛋白基因统计

“+”：有 ； “-”：无

基因名称菌株编号LM6072小LM6072大LM3251LM2941LM502-2LM2956LM5470LM4786LM5563LM5570LM3103-1LM6008lmo2026--+---------lmo2396+-+---+--++-inlJ++++++++++++lmo0171+-++-+++-++-lmo0732+-++-+++-++-lmo0175++++++++-+++lmo0327+-----+--++-inlI++-+++++++++lmo0835+++++++-++++lmo1413++++++++++++lmo2178++++++++++++lmo2179-+++++++++++lmo0130+++++++++++-lmo0159++++++++-++-lmo0160++++++++++++inlH++++++++++++lmo0320---+-+-++--+lmo0331++++++++++++lmo0435-----+------lmo0463-+-+++-++-++lmo0514-+++++++-+++lmo0550+-++++++++++lmo0610++++++++++++lmo0627+-++-+++-++-lmo0725+++++++-++++lmo0801--+--+------lmo0842+-+---+-+++-lmo0880-++++-++++++lmo1115------------lmo1136+-++-+++-++-lmo1289---+-+-+----lmo1290-+++++++-+++lmo1666+++++++-++++lmo1799++++++++++++lmo2085++++++++++++lmo2576+-++-++++++-lmo2714++-++++-++++inlA++++++++++++inlE--++--++-++-inlF+-+++-++-++-inlG+-+---+--++-携带率/%70．756．180．580．561．078．082．970．756．182．985．456．1

“+”：有 ； “-”：无

目前，由LM引起的食物中毒越来越多。自1926年首次分离到本病病原后，李氏杆菌病现已呈世界性分布。近年来因食品污染本菌而引起的食物中毒病例频繁发生，使李氏杆菌病作为一种重要的食源性传染病在世界范围内对食品安全及人类健康造成极大的危害[10]。我国近年来将食品中单增李斯特菌的污染检测作为一项必检的安全指标，WHO 将单增李斯特菌列为20世纪90年代食品中四大病原菌(致病性大肠杆菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭菌)之一[11]。本试验采用PCR检测技术检测了食品源LM分离株的LPXTG蛋白基因，为探明食品源LM的致病性有着重要的意义。

[1] 吴学林,曹树珠,马勋. 单核细胞增生性李斯特菌srtA基因的克隆与原核表达[J].石河子大学学报(自然科学版)，2015，33(2)：64-68.

[2] 崔焕忠,乔立桥,王义冲. 单核细胞增生性李斯特菌的主要毒力因子及其致病机理[J].中国畜牧兽医, 2010 , 37(1) : 128-133.

[3] 闫韶飞,裴晓燕,杨大进,等. 2012 年中国食源性单核细胞增生李斯特菌耐药特征及多位点序列分型研究[J].中国食品卫生杂志, 2014 , 26(6) : 527-542.

[4] 赵一鸣,石磊,孟赫诚,等. 食源性单增李斯特菌的ERIC-PCR和Sau-RCR分型研究 [J] . 食品与机械 , 2015 , 31(1) : 54-58.

[5] Mariscotti J F, Quereda J J, Pucciarelli M G. Contribution of sortase A to the regulation of Listeria monocytogenes LPXTG surface proteins.[J]. International Microbiology the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology, 2012, 15(1):43-51.

[6] 王海艳,刘中学,石新华,等. 单增李斯特菌及其表面蛋白的研究进展[J] . 检验检疫科学 , 2006(2): 76-80.

[7] Mariscottia J, Queredaa J, García-del Portilloa F,etal. The Listeria monocytogenes LPXTG surface protein Lmo1413 is aninvasin with capacity to bind mucin[J]. International Journal of Medical Microbiology,2014,304：393-404.

[8] M Graciela Pucciarelli, Enrique Calvo, Christophe Sabet,etal.Identification of substrates of the Listeria monocytogenes sortases A and B by a non-gel proteomic analysis[J]. Proteomics, 2005(5):4 808-4 817.

[9] Popowska M, Markiewicz Z. Characterization of Listeria monocytogenes protein Lmo0327 with murein hydrolase activity[J]. Archives of Microbiology, 2006, 186(1):69-86.

[10] 胡杨峰. 食源性单核细胞增生李斯特菌分布及其内化素基因分布研究[D] . 保定：河北农业大学，2009.

[11] 巢国祥,焦新安,徐勤,等. 8类食品单核细胞增生李斯特菌流行特征及耐药性状研究[J].中国卫生检验杂志,2005 , 15(5):519-521.

DetectionofLPXTGproteingenesinFood-borneListeriamonocytogenes

DING Jian, MA Xun, CHEN Shuo, CAO Shu-zhu, WANG Bei-bei, DU Dong-dong , ZHANG Qi-wen

(Shihezi University School of Animal Science and Technology,Shihezi 832000, China)

Listeria monocytogenes (Lm) is well known as one of the most important foodborne pathogens, posing a great threat to the health of human and various livestock and poultry. Lm has a variety of virulence-associated proteins that are closely involved in the pathogenicity. One type of the surface proteins which have a conserved LPXTG motif at COOH-terminal cell can be cleaved by sortase and anchored peptidoglycan to present on the cell surface to play a role in virulence. Twenty-four food-borne Lm strains were isolated from different foods. Forty-one primers were designed and synthesized for putative LPXTG surface proteins. The geges were detected by PCR and gel electrophoresis imaging system. The results showed that the rate of carrying LPXTG protein genes in different LM isolates was different. And 12.5% Lm isolates(3/24)carried more than 85% LPXTG protein genes.The detection rate of LPXTG protein genes was different. Among the 41 LPXTG protein genes, only 7 genes were 100% detected ; 3 genes were under 20%; the Lmo1115 gene was not detected. It is of importance for studying the pathogenicity of food-borne Lm to test the distribution of LPXTG motif surface proteins.

Listeriamonocytogenes; LPXTG motif surface protein ; PCR

MA Xun

R378

A

0529-6005(2017)08-0017-05

2016-12-02

国家自然科学基金(31360614)

丁剑(1991-)，女，硕士生，研究方向为动物传染病的诊断与防治，E-mail:598283567@qq.com

马勋，E-mail:maxun779@126.com