双亲性载体HA—GMS的构建及载胰岛素纳米乳的评价

朴明贯 左阿龙

摘 要： [目 的]利用酯化反应合成单硬脂酸甘油酯修饰双亲性透明质酸载体（HA-GMS），优化处方制成油包水（W/O）型HA-GMS纳米乳，并胰岛素为模型药物研究理化性质，提高胰岛素胃肠道稳定性和生物利用度。

[方 法]以单硬脂酸甘油酯（GMS）酯化透明质酸（HA）的羧基合成双亲性化合物HA-GMS，以纳米乳相区面积为考察指标，对制备空白纳米乳的油相，内水相pH进行优化，加制备HA-GMS，研究浓度对空白纳米乳的影响；制备W/O型HA-GMS胰岛素纳米乳，进行理化性质的考察和酶降解实验，并以大鼠为实验动物，对胰岛素纳米乳的降糖效果进行考察。

[结 果]实验结果表明，透明质酸的羧基和单硬脂酸甘油酯的羟基酯化成功。HA-GMS的胰岛素纳米乳的载水量达到6%左右，平均粒径为33.9nm，通过透射电镜显示胰岛素纳米乳为圆整的球形或椭圆形，大小较均匀。胰岛素纳米乳酶降解实验中，90分钟时胰岛素剩余百分比分别为21%和37%，显著提高胰岛素的胃肠道稳定性。药效学研究表明口服胰岛素纳米乳有一定降糖作用，灌胃4小时大鼠血糖含量达到初始值的70.28%，作用效果达到12小时左右。

[结论]HA-GMS纳米乳给药系统能显著增加胰岛素在胃肠道中的稳定性，在大鼠体内显著增加胰岛素的生物利用度，并延长胰岛素降糖作用时间。

关键词： 透明质酸，胰岛素，W/O纳米乳

【中图分类号】 R94 【文献标识码】 A【文章编号】 2236-1879（2017）20-0297-02

多肽类药物口服给药面临的问题是胃肠道环境的影响和肠道粘膜的低通透性，口服首先被胃蛋白酶水解，后进入肠道，遭各种蛋白酶的降解致多肽类药物口服生物利用度降低。对蛋白质类药物结构进行化学修饰，能增加脂溶性，提高膜渗透性和抵抗酶分解能力，但修饰后的前药生物活性往往降低，体内代谢动力学性质也会因一级结构的改变发生变化，产生新分子实体的安全性评价也是长期过程[1]。研究结果显示，多肽类口服生物利用达到上限，有必要探索新口服吸收方法及药物传递系统。

纳米乳是表面活性剂分子在油水界面上，疏水端伸向油相，亲水端伸向水相自发形成有稳定结构的剂型[2]，油包水（W/O）型微纳米乳一直作为制备蛋白质类药物的给药系统[25]。有效使用多种生物可降解材料及具有生物相容性的材料为药物的载体，使药物与相应的载体材料形成尺度在纳米级的给药系统。这种新型的纳米药物传递系统由于其结构能对药物進行有效的包裹，口服能对药物在胃肠道中具有一定的保护作用[3]，较小粒径也增加在胃肠道中的比表面积，从而增加吸收面积[4]，新功能性载体材料的应用，也能改善制剂在胃肠道中的吸收和保护作用[6]。

透明质酸是在细胞外基质、结缔组织和高等动物的器官中广泛分布天然蛋白多糖[7]。将采用透明质酸合成单硬脂酸甘油酯酯化的HA-GMS双亲性化合物，制备W/O型HA-GMS载胰岛素纳米乳，W/O型HA-GMS纳米乳对蛋白质类药物的保护作用。

1.材料与仪器

材料。

透明质酸；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠，丙酮；透析袋；碳二亚胺盐酸盐；N-羟基琥珀酰亚胺；单硬脂酸甘油酯；吐温80；司盘80；乙醇；肉豆蔻酸异丙酯；中链甘油三酯；大豆油；胰岛素；磷酸缓冲液；硫酸钠；乙腈；四氧嘧啶；SPF级，Wistar鼠，体重240-260g，雄性。

1.1仪器。

磁力搅拌器；超速冷冻离心机；冷冻干燥机（Virtis BT2k，SP SCIENTIFIC）；超声清洗器；实验室pH计（STARTER 2100）；漩涡仪（West Thorndale Ave）；电子天平（BSA2201）；核磁共振仪（AV-300，）；傅里叶红外光谱测定仪；血糖仪（SURESTEP PLUS）；JL-1197型激光粒度分布测试仪；HP1100高效液相色谱仪；日本JEM-1200EX透射电镜。

2.方法与结果

2.1HA-GMS纳米口服给药系统的制备和优化。

2.1.1HA—GMS的合成与表征。

对HA的羧基进行共价修饰，在羧基上连接疏水性基团GMS，增加HA的疏水性。首先把HA和EDC/NHS分别溶解在PBS（pH为7.4），搅拌2h，将溶液滴入GMS丙酮溶液中，反应24h，将得到的混合物在15000rpm，4℃下离心20min/次，直到不浑浊，将上清液用透析膜透析3天[9]，冷冻干燥得到样品粉末，用红外光谱和核磁共振氢谱表征结果如图1和图2。

在图1中，3466cm-1左右为HA的-OH基团，1800-1600为C=O，1260-1000为C-O单键，在2922.16附近产生伸缩振动，1400-1500的伸缩为sp3，sp2的C-H，经酯化引入碳水化合物链，HA-GMS比HA所有吸收都尖锐，验证GMS单体连接新HA链。图2，HA-GMS在1ppm左右出现的峰进一步证明HA连接含H基团。透明质酸的羧基和单硬脂酸甘油酯的羟基化成功。

2.2.2纳米乳的制备和优化。

选择常见油相，表面活性剂，助表面活性剂混合后，滴水相，超声分散5min，采用单因分析法分别考察纳米乳的最佳油相，最适HLB值，应用软件Origin8绘制伪三相图，用AutoCAD计算处方相图中纳米乳面积考察空白处方，选择纳米乳相区面积较大的处方对水相pH进行考察，为后续载胰岛素筛选最佳酸性水相[10]。

IPM在HLB=5，7的时候有较大的纳米乳相区面积，分别为5.73%和3.38%。选择IPM为油相在HLB值为5-8之间进行进一步筛选。HLB=9时，各纳米乳相区均较小，HLB值较小时倾向形成油包水体系，较大时更倾向形成水包油体系，选择三种在纳米乳中安全性较高的三种油相，分子体积大小排列为MCT

HLB=5，Km=2和HLB=8，Km=4时均有较大的纳米乳相区面积，分别为4.58%和4.42%。Km=2时，纳米乳相区的面积随着HLB值增大而减小，不符合HLB理论。Km=3時，随着HLB值的增大，纳米乳相区无显著变化，Km=4时，纳米乳相区有增大的趋势。据不同Km值和HLB值得到的纳米乳相区面积，综合考虑存放过程中，发现HLB=8，Km=4时虽有较大的纳米乳相区面积，但纳米乳会产生分层现象，综合考虑制剂的载水量，选择载水分别为5.75%，4.95%，3.28%的三个处方进一步考察，处方组成如表1。

图5看出，在1号和2号处方中，内水相pH等于2，有较大的载水量，处方3中，pH对载水量几乎无影响，可能是因为处方3中，载水量较少，pH对载水量的影响不显著，在空白纳米乳载亲水性药物时，在不影响药物稳定性前提下，内水相pH为2时有较大载药量。

2.2.3HA-GMS纳米乳的制备和优化。

制备的理论可以提高油水界面的稳定性的HA-GMS为两亲性材料，选择载水量较高的处方，在空白纳米乳中加入不同浓度的HA-GMS，测载水量变化，研究HA-GMS对纳米乳制剂稳定影响。

测定结果可看出，HA-GMS在0.5-12mg/ml时载水量无显著变化，浓度大于12mg/ml时，载水量急剧下降。制备过程发现，纳米乳制备一定时间，未加入HA-GMS的纳米乳分层现象明显，HA-GMS能提高纳米乳的稳定性。

2.2HA-GMS胰岛素纳米乳口服载药系统的评价和酶降解实验。

2.2.1胰岛素纳米乳的粒径和形态。

选择载水量较高的处方1，加胰岛素，用负染色法制备样品：取胰岛素纳米乳适量，取1-2滴于铜网上，静一段时间，自然晾干，滴2%磷钨酸溶液，负染3min，自然挥干。透射电子显微镜下观察形态，拍照，多分散激光粒度仪测量粒径大小，结果如图7，图8所示。

制得胰岛素纳米乳为球形或椭圆形，大小较均匀。因测前存放时间较长，有一定聚集现象。图8粒径分布看出，粒径分布较窄，大小分布均匀，平均粒径为33.9nm，较小粒径使乳滴不易发生聚集，利保持胰岛素纳米乳的稳定性。

2.2.2 HA-GMS胰岛素纳米乳体外酶降解实验。

依最优处方制备胰岛素纳米乳，用0.01mol/L盐酸配置相同药物含量的胰岛素溶液，分别加入到配置好的人工胃液，37℃孵化，在0，3，6，9，15，30，60，90min应用反透析法在透析袋内取样200μL，高效液相色谱法测定胰岛素含量，色谱柱：美国Thermo Hypersil GOLD C18柱，流动相为0.1mol/L磷酸二氢钠-0.1mol/L硫酸钠-乙腈，用磷酸调节pH为3.0；流速为1.0ml/min；紫外检测波长为214nm；进样量为20μL，柱温为30℃[11]。计算胰岛素的剩余率。

在胃蛋白酶中，胰岛素原料药18min左右即降解完全，在胃液中，90min剩余百分含量约为21%。在胰蛋白酶的降解下，胰岛素90min降解量约为96%，胰岛素制剂在胰蛋白酶的降解下90min剩余百分含量约为37%。结果显示，胃蛋白酶对胰岛素制剂的降解效果较强，纳米乳制剂均对胰岛素有一定的保护作用。

2.3口服HA-GMS胰岛素纳米乳的大鼠体内降血糖实验。

取鼠15只，饲养3天，禁食12时，照150mg/kg腹腔注射四氧嘧啶，在充足日光照射下饲养5天，造模5天，禁食12时，尾静脉取血，照血糖仪说明方法测定大鼠空腹血糖浓度，血糖浓度大于11mmol/L为造模成功[12]。

取糖尿病鼠12只，随机分4组，每组3只，分别为载药纳米乳组，原料药组，空白纳米乳组，对照组，载药纳米乳组和原料药组给药相当原料药20IU/kg，实验过程禁食，自由饮水，于0，1，2，3，4，6，8，10，12h尾静脉取血，血糖仪测定血糖值，算各时间血糖浓度占初始血糖浓度百分比，绘制血糖曲线。

原料药组，空白纳米乳组与对照组对比均无显著差异，说明纳米乳辅料对血糖值无显著影响，胰岛素纳米乳制剂组与其他组相比，降糖效果显著，降糖效果持久。原料药组与载药纳米乳组对比，证明表面活性剂和油相共同包裹的胰岛素有效避免胃肠道中胃蛋白酶水解，使胰岛素不受胃肠道中环境的影响。制备W/O型纳米乳可以有效促进胰岛素口服吸收。

3.讨论

原料药组与载药纳米乳组对比，证明双亲性载体HA-GMS构建纳米乳有效避免胰岛素在胃肠道中被胃蛋白酶水解，纳米乳内水相给胰岛素提供稳定的环境，胰岛素不受胃肠道中环境的影响。

参考文献

[1] 崔福德，石凯，寸冬梅.蛋白多肽类药物纳米粒口服给药系统的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2010，27（12）：946-951.

[2] Schick M J.Reverse micelles，edited by P. L.Luisi and B.E.Straub，Plenum，New York，1984，354 pp.Price：$55.00[J].Journal of Polymer Science Polymer Letters Edition，1985，23（3）：163-164.

[3] 梅建生.口服胰岛素纳米载体的研究进展[J].中华实用医药杂志，2004.

[4] 姜伟明，郭圣荣.载体材料在改善纳米粒肠道吸收研究中的应用[J].南京中医药大学学报，2013，29（3）：297-300.