发酵法生产十二碳二元酸的高效菌株复合筛选的研究

姚嘉旻 卢利玲

【摘要】选取现有保藏菌株作为实验出发菌株，利用两步浓缩法筛选α，ω?氧化性强、β?氧化性弱的酵母菌优势菌株。经发酵罐验证，发酵155h产酸约180克/升，达到了筛选产酸水平高、烷烃转化率高的优势菌株的目的，增加二元酸项目的竞争力及应变能力。

【关键词】十二碳二元酸；复合诱变；显色筛选

本课题针对长链二元酸工艺的研究进展及其现状，通过系列诱变筛选来挑选出烷烃转化率高、发酵周期短、产酸性能更强的优势菌株，为发酵法生产长链二元酸高效菌株的筛选提供依据。

一、材料与方法

（一）材料

1.出发菌种：经初步产酸评价后，初步确定6株保藏菌株作为诱变育种出发菌株。

2.试剂

糖蜜，尿素，酵母膏，均为工业级。

3.培养基

（1）筛选培养基：在种子培养基成分。（2）基础上有所改变，如下：蔗糖碳源培养基、烷烃碳源培养基；显色培养基。（3）发酵培养基：成分与种子培养基一致，烷烃量根据实际要求足量添加。

（二）方法

1.分析方法

（1）产酸量。摇瓶发酵、破乳抽提，用标准氢氧化钠溶液标定二元酸产酸含量。（2）二元酸成分同。（3）提纯长链二元酸产品，干燥后经气相色谱分析测定二元酸成分。

2.初筛程序

出发菌株→筛选培养基（初筛A）→产酸显色培养基（初筛B）→初筛菌株→初筛产酸验证。

3.复筛程序

初筛菌株→物理化学诱变→产酸显色培养基（复筛A）→秋水仙碱产酸培养基→铬酸钾产酸培养基（复筛浓缩B）→复筛优势菌株。

二、结果与讨论

（一）复筛实验结果

1.紫外诱变

图1分析，热带假丝酵母菌的紫外诱变致死率与照射时间呈正相关性；同时，紫外诱变的正突变率随照射时间的延长呈先增长而后降低的变化趋势，选择紫外诱变照射时间为150秒较适宜，其对应致死率及正突变率分别为88%、40%.

2.超声波诱变

诱变时长为12min时，对应致死率及正突变率分别为94%、45%，而诱变时长为15min时，对应致死率及正突变率分别为99%、48%，选择诱变时间为12min更为适宜。再经两步浓缩法获得诱变正突变菌株56株。

（三）產酸验证

1.摇瓶产酸验证

出发菌株QJ-EY09初始产酸水平仅为75g/L，经复合诱变筛选流程，突变菌株最高产酸水平约185g/L，产酸水平是出发菌株的2.4倍。

2.发酵罐产酸验证

选择摇瓶产酸对应烷烃转化率较高的诱变菌株，经发酵罐放大验证：发酵周期为140h时，发酵产酸水平为185g/L，达到既定筛选优势菌株效果。

三、讨论

选取生产保藏菌株QJ-EY09作为诱变育种出发菌株，合理制定紫外-超声波诱变方法，复筛出正突变菌株；利用两步浓缩法及显色平板筛分，获得α，ω-氧化增强、β-氧化减弱的诱变突变株56株；经发酵罐验证，发酵140h产酸185克/升，达到了筛选产酸水平高、烷烃转化率高的优势菌株的目的。

参考文献

[1]焦鹏，华玉涛，李书良.热带假丝酵母转化烷烃过程中P450酶活的研究[J].微生物学报，2001，41（01）：117～120.

[2]欧阳晶，荣东，郝秀珍.热带假丝酵母酰基辅酶A氧化酶的纯化及性质研究[J].微生物学报，2002，42（06）：713～719.

[3]赵兴青.发酵法生产十三碳二元酸的试验研究[D].沈阳：东北大学，2003.

[4]刘树臣，李淑兰，金平.十二碳二元酸发酵研究[J].微生物学报，2002，42（06）：748～780.

作者簡介：姚嘉旻（1981—），男，江苏淮安人，研究方向：石油产品相关的发酵工程及分离工程。