长柱重楼中主要甾体皂苷类成分的定性定量分析

黄圆圆 康利平 彭华胜 刘大会 郝庆秀 赵加六 陈敏 黄璐琦

[摘要]为了从化学成分上研究长柱重楼是否具有重楼药材代用品的开发价值，该研究利用UPLCQTOF MS比较了长柱重楼和滇重楼的化学成分，并进一步利用HPLCUV同时测定了77株不同来源的长柱重楼中8 种重楼皂苷的含量。结果显示长柱重楼和滇重楼的化学成分相似，长柱重楼化学成分更为复杂，鉴定的22个主要共有峰均为甾体类化合物。不同株长柱重楼中重楼皂苷的含量具有一定的差异，其中药典规定4种甾体皂苷（重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ）总量最高的为330%，最低的为0068%，8种甾体皂苷总量最高的为618%，最低的为071%。长柱重楼中78%的样品符合《中国药典》要求，整体质量较为稳定，可以作为重楼替代品种进行研究开发。

[关键词]重楼； 长柱重楼； 甾体皂苷； 定性定量分析

Qualitative and quantitative analyses of primary saponins in Paris forrestii

HUANG Yuanyuan1，2， KANG Liping1， PENG Huasheng2， LIU Dahui3， HAO Qingxiu1，

ZHAO Jialiu4， CHEN Min1*， HUANG Luqi1*

（1 State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230012， China；

3College of Pharmacy， Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430065， China；

4Lanping County in Ecological Industry Co.， Ltd， Nujiang 673100， China）

[Abstract]In order to study whether Paris forrestii could be developed as a substitute of Paridis Rhizome， chemical compositions of P. forrestii and P. polyphylla var yunnanensis were investigated by UPLCQTOF MS In addition， the contents of eight primary steroidal saponins in 77 batches of P. forrestii samples from different habitats were simultaneously determined by HPLCUV The results showed that P. forrestii and P. polyphylla var yunnanensis have similar chemical compositions， and all 22 major common peaks were identified as steroid derivatives Meanwhile， there were some differences in the contents of saponins in P. forrestii samples from different habitats The contents of 4 steroidal saponins in Chinese Pharmacopoeia ranged from 0068% to 330%， and the highest content of the 8 kinds of steroidal saponins was 618%， while the lowest was just 071% Moreover， 78% of P. forrestii samples were in conformity with the requirements of Chinese Pharmacopoeia， indicating that P. forrestii samples had relatively stable quality and could be further studied as a substitute for Paridis Rhizome

[Key words]Paris； Paris forrestii； steroidal saponins； qualitative and quantitative analyses

2015年版《中国药典》[1]记载重楼来源于滇重楼Paris polyphylla Smith var yunnanensis （Franch）Hand.Mazz和七叶一枝花P. polyphylla Smith var chinensis （Franch） Hara的根茎。重楼中主要含有甾体皂苷类成分，目前已报道的有160余种，这类成分具有止血、抗肿瘤、抗菌、消炎、镇痛等药理活性[27]。重楼是云南白药、宫血宁、金复康口服液、楼连胶囊和季胜德蛇药片等中成药的主要组成药味[8]，具有显著的临床疗效和经濟价值。

李恒等对中国重楼资源现状进行了评估，发现重楼消费量大于野生重楼储存量的总和，导致重楼资源濒临枯竭[9]。随着重楼需求量的不断增长和重楼野生资源的减少，滇重楼和七叶一枝花的产量已经不能满足市场供应。重楼属植物长柱重楼P. forrestii （Takht） H Li在民间常做重楼药材使用[6，10]，且长柱重楼具有易栽培、产量高等特性。《云南植物志》中也记载长柱重楼以根茎入药，用于无名肿毒、蛇虫蛟伤、腮腺炎、扁桃腺炎，主要分布于云南西北部和西部，西藏东南部 [11]。课题组前期资源调查时发现，长柱重楼在云南怒江州和保山市一带具有一定的野生分布和一定量的人工栽培。目前长柱重楼的化学成分鲜有报道，仅李朋等对7株长柱重楼进行了含量测定分析[12]。前期对15种重楼属植物研究时发现，长柱重楼具有重楼代用品的开发潜力。为此，课题组多次从云南怒江州和保山市收集了多批次长柱重楼，进一步研究长柱重楼P. forrestii （Takht） H Li和滇重楼P. polyphylla var yunnanensis化学成分的相似性，并对77株长柱重楼中的重楼皂苷Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ， Ⅶ， H， V， 薯蓣皂苷和纤细薯蓣皂苷等8种活性皂苷进行了含量测定研究，为长柱重楼的开发和质量评价提供依据。endprint

1材料

液相为Waters Acquity HClass UPLC TM超高效液相色谱仪串联外接柱温箱（包括四元溶剂管理器、真空脱气机、自动进样器、外接柱温箱、PDA检测器、Empower 3工作站，美国Waters 公司），Mettler TOLEDO XS105DU分析天平（瑞士梅特勒公司），SB800 DTD超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司），电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

液质联用为Waters Acquity IClass UPLC TM串联Waters Zevo G2S QTOF MS（美国Waters 公司），色谱柱为Waters Acquity HSS T3色谱柱（21 mm× 100 mm， 18 μm），流动相为01% 甲酸乙腈（A）水（B）梯度洗脱，流速05 mL·min-1，柱温40 ℃。离子化模式为电喷雾正、负离子，毛细管电压为2 000 V（负）和500 V（正），锥孔电压为30 V，除溶剂气体为氮气，900 L·h-1，除溶剂温度为450 ℃，离子源温度为100 ℃，扫描范围为m/z 50～1 500，碰撞气体为氩气。低能量扫描时trap电压为6 eV，高能量扫描时trap电压为50～70 eV（负）和45～60 eV（正）。准确质量数用leucine enkephalin作校正液。

甲醇（色谱纯，UN 1230）和乙腈（色谱纯，UN 1648）购自德国默克股份有限公司，乙醇（分析纯，批号20160918）购自北京化工厂，超纯水自制（Thermo Barnstead GenPure UV/UF）。

对照品重楼皂苷Ⅶ（纯度925%，批号111593201303）、重楼皂苷Ⅵ（纯度951%，批号111592201203）、重楼皂苷Ⅱ（纯度934%，批号111591201103）和重楼皂苷Ⅰ（纯度936%，批号111590201604）购自于中国食品药品检定研究院，重楼皂苷H（纯度>98%，批号H036161001）、重楼皂苷Ⅴ（纯度>98%，批号H036150215）、薯蓣皂苷（纯度>98%，批号S048160408）、纤细薯蓣皂苷（纯度>98%，批号X053151111）购于北京融诚鑫德科技发展有限公司。

长柱重楼釆自云南省怒江州和保山市，滇重楼釆自云南省文山市。长柱重楼与滇重楼的植物植物形态和根茎见图1，长柱重楼样品信息见表1，所有样品经安徽中医药大学彭华胜教授鉴定为长柱重楼P. forrestii和滇重楼P. polyphylla var. yunnanensis。植物标本存于中国中医科学院中药资源中心。

2方法和结果

21化学成分定性分析

应用UPLCQTOFMS在上述色谱和质谱条件下对滇重楼和长柱重楼进行分析。通过正、负准分子离子峰的精确分子质量确定化合物的相對分子质量和可能的分子式，再通过高能量扫描时产生的碎片离子推测碎片的元素组成和结构；最后通过和已有文献中甾体皂苷的色谱行为和质谱行为进行比对并结合文献报道的成分，鉴定色谱峰可能的结构。滇重楼和长柱重楼的基峰离子比较色谱图见图2。

22含量测定分析[16]

色谱条件为资生堂CAPCELL PAK ADME 色谱柱（46 mm×250 mm， 5 μm）；流动相乙腈（A） 水（B）梯度洗脱：0～9 min，35%～44% A；9～22 min，44% A；22～38 min，44%～47% A；38～39 min，47%～98% A；流速08 mL·min-1；检测波长为203 nm；柱温21 ℃；进样量10 μL。重楼皂苷对照品和长柱重楼样品的HPLC图，见图3。

23供试品溶液的制备

取长柱重楼药材粉末约05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70% 乙醇25 mL，称重，加热回流30 min，放冷，再称重，用70% 乙醇补足失重后摇匀，12 000 r·min-1高速离心15 min后取上清液过022 μm滤膜，取续滤液即得供试样品溶液。

24对照品溶液的制备

分别精密称取重楼皂苷Ⅶ、H、Ⅵ、Ⅱ、Ⅰ、Ⅴ、薯蓣皂苷和纤细薯蓣皂苷，甲醇超声溶解，配制成质量浓度分别为0334，0348，0267，0327，0361，0340，0362，0381 g·L-1 的8种混合对照品母液，并逐级稀释2倍，配成7个浓度。

25含量测定的方法学考察

251线性关系每个浓度混合对照品进样10 μL，在上述21项色谱条件下分析，以峰面积为纵坐标，以各对照品的质量浓度为横坐标做标准曲线。以信噪比S/N=10为最低定量下限，信噪比S/N=3为最低检测下限。结果表明8种重楼皂苷有良好的线性范围和线性关系，见表3。

252精密度实验取混合对照品溶液，在以上色谱条件下连续进样6次，重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ色谱峰峰面积的RSD（n=6）分别为070%，080%，080%，10%，090%，070%，080%，090%，结果表明仪器精密度良好。

253样品的重复性试验取长柱重楼药材粉末约05 g，平行6份，精密称定，用以上供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在以上色谱条件下分析，计算样品中重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ含量的RSD 分别为12%，095%，19%，22%，070%，054%，064%，14%，结果表明实验重复性良好。

254稳定性试验取供试品溶液分别于0，2，4，8，16，24，48，72 h进样测定，供试品溶液中8种重楼皂苷的色谱峰峰面积的RSD（n=8） 分别为010%，050%，13%，090%，12%，060%，050%，060%，结果表明供试品溶液在3 d内稳定性良好。endprint

255加样回收率试验取已知含量长柱重楼药材粉末约025 g×9，精密称定，按照相当于药材中重楼皂苷80%，100%，120% 的比例，分别精密加入混合对照品溶液25 mL， 同上供试品的制备方法，在上述的色谱条件下进行分析，计算重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ的回收率，回收率=（C-A）/B×100%，A为所用重楼药材中含被测成分的量，B为加入对照品量，C为混样的实测值，试验结果见表4。

3讨论

从UPLCQTOF MS的分析结果看，长柱重楼和滇重楼的化学成分相似。长柱重楼含有滇重楼主要的色谱峰，但其薯蓣皂苷元糖苷的种类比滇重楼更复杂。从含量测定的整体结果看，长柱重楼中药典规定的重楼皂苷Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ， Ⅶ的总量平均量在123%，远高于药典规定的06%；另外重楼皂苷H， V， 薯蓣皂苷和纤细薯蓣皂苷的平均总量在193%，高于药典4种皂苷的总含量；而8种皂苷总量平均在317%，这一结果也略高于李朋等[12]所测的平均含量，其中本研究增加了薯蓣皂苷含量的测定（平均量056%），而没有测定皂苷D的量（平均量0005%）。从个体来看，长柱重楼中药典4种皂苷最高量在330%，最低量在0068%，有22%的样品不符合药典的要求；8种皂苷最高量在618%，最低量在071%，相差近9倍。从甾体皂苷的类型上看，3个偏诺皂苷元类糖苷的平均量在020%，5个薯蓣皂苷元类糖苷的平均量在297%，后者是前者的14倍；偏诺皂苷元类糖苷量最高在115%，最低的不在检测范围。根据偏诺皂苷元类糖苷的止血活性强于薯蓣皂苷元类糖苷，偏诺皂苷元类糖苷的细胞毒活性弱于薯蓣皂苷元类糖苷的研究结果[1719]，推测长柱重楼的抗肿瘤的活性可能会更强。

在长柱重楼的采样过程中发现长柱重楼具有一些不同的性状变异表型，这些变异的长柱重楼的含量通常较低，比如1～15号和21～32号均为稍有表型变异的长柱重楼，27个样品中有16个不符合药典要求，不合格率在593%左右，而其它较为典型的长柱重楼只有一株不符合药典要求。根据本研究结果和前人含量测定结果[2022]对比可知，相比重楼正品来源滇重楼和七叶一枝花，长柱重楼中的皂苷含量不低于两者，甚至更高，因此值得对长柱重楼的化学成分进行深入研究并对其生物活性开展评价，并作为重楼的代用品进行深入研究与开发。

[致谢]长柱重楼采样和鉴定过程中得到了云南彝道农业发展有限公司和中国科学院昆明植物研究所李恒研究员的帮助和支持。

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[责任编辑丁广治]endprint