细胞膜通透性的调节对木醋杆菌产细菌纤维素的影响

汤卫华贾士儒

（1天津现代职业技术学院生物工程学院，天津300350） （2天津市工业微生物重点实验室，天津300457）

细胞膜通透性的调节对木醋杆菌产细菌纤维素的影响

汤卫华1*贾士儒2

（1天津现代职业技术学院生物工程学院，天津300350） （2天津市工业微生物重点实验室，天津300457）

细菌纤维素（Bacterial cellulose，BC）是一些细菌的初级代谢产物，主要起到保护层的作用。BC在化学结构上与植物纤维是相同的，但其极为精致的网状结构赋予了BC更多的性能。因此BC在医用材料、造纸、纺织以及食品等领域中有广泛的应用。近几年来，BC已成为研究的热点，但由于成本高、产量低、技术转化脱节等问题，使BC难以实现规模产业化。

人为改变细胞膜的通透性，可以改变原料的输入或代谢产物的排出速率，同时也可能对细胞造成损伤，这是实现代谢人工调控的重要方法之一。在微生物代谢中，改变细胞膜通透性是有效生产代谢产物的一种常用方法。BC的生物合成是一个极其复杂的生化过程，受到诸多因素的影响，细胞膜通透性就是其影响因素之一。目前仅有邓毛程等人在这方面进行了初步探讨。本文采用化学法（添加表面活性剂和有机溶剂）和物理法（超声波），综合研究细胞膜通透性的调节对木醋杆菌产BC的影响。

1 材料与方法

1.1 菌种

M12木醋杆菌（Acetobacter xylinum），天津市工业微生物重点实验室保藏。

1.2 培养基

液体培养基的配制：取胰蛋白胨5 g，酵母粉5 g，柠檬酸1 g，葡萄糖20 g，Na2HPO45 g，加蒸馏水1000mL，加热溶解，调整pH为6.0，121℃灭菌20min。

1.3 培养方法

1.3.1 种子培养

将1～2环斜面种子接入装有50mL～100mL液体种子培养基的三角瓶中，在30℃下160 r/min培养 24 h～30 h。

1.3.2 液体培养

以体积分数6%的接种量接入液体培养基中，30℃静置培养6 d。

1.4 分析方法

1.4.1 BC的提取和处理方法

培养结束后将膜取出，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2。80℃干燥至恒重，进行称重。纤维素的产量表示为：g纤维素/L培养基。

1.4.2 菌体量的测定

用0.85%的生理盐水配制pH为4.6～4.8的0.1 mol/L的醋酸钾－醋酸缓冲溶液100mL，取纤维素酶2 g放入缓冲溶液中活化，置冰箱备用。测定时，每次取活化好的纤维素酶溶液2mL在50℃、pH 5.0条件下充分水解2 h，适当稀释后，于600nm波长下测吸光值（OD600nm值）。

2 结果与讨论

2.1 吐温-80添加量对BC产量的影响

以体积分数6%的接种量接入液体培养基中，30℃下培养24 h后，在液体培养基中分别添加1%、2%、4%、6%、8%的吐温-80（已灭菌），研究吐温-80添加量对木醋杆菌BC产量的影响，结果如图1所示。

图1 吐温-80添加量对BC产量和菌体生长的影响

由图1可知，吐温-80对BC的生物合成具有明显的促进作用。随着吐温-80添加量提高，BC产量随之提高；当添加量提高至4%时，细菌纤维素的产量达5.9 g/L，是对照组的1.23倍。吐温-80添加量进一步提高至6%和8%，BC的产量开始下降。同时研究发现，吐温-80对木醋杆菌的生长没有促进作用，当吐温-80的添加量小于4%时，木醋杆菌的生长受到轻微的抑制作用；而添加量增至6%时，木醋杆菌的生长受到明显的抑制，其菌体量仅为对照组的72.3%，同时BC产量开始下降。一般来讲，木醋杆菌生长的同时伴随着BC的分泌，而这个结果与该结论不符。有研究认为BC的超细网格结构可以保护木醋杆菌不受外界环境如高温、干燥、紫外线灯等恶劣条件的影响，原因可能是木醋杆菌受到外界不利环境的刺激后，会加快合成细菌纤维素来进行自我保护。该试验结果与邓毛程等人的研究结果相似。

2.2 有机溶剂对BC产量的影响

有机溶剂会溶解在细胞膜内，破坏细胞膜的完整性，影响细胞膜作为屏障和能量转换功能。以体积分数6%的接种量接入液体培养基中，30℃下培养24 h后，在液体培养基中分别添加不同量的丙酮、氯仿和甲苯，继续培养5 d，研究有机溶剂的种类及添加量对木醋杆菌BC产量的影响，结果如图2所示。

图2 有机溶剂对BC产量和菌体生长的影响

图2的结果表明，有机溶剂对BC的生物合成无明显的促进作用。当丙酮添加量为0.5%时，BC产量达到5.42 g/L，是对照组的1.03倍，而进一步提高丙酮的添加量，BC产量下降。当氯仿和甲苯的添加量为0.5%时，木醋杆菌的生长和BC的生物合成均有微量的提高。但是当两者的添加量继续提高，菌体生长和BC合成均受到明显的抑制。当氯仿和甲苯的添加量分别达到3.0%和1.5%时，菌体量和BC产量均降至0。

这几种有机溶剂中，氯仿和甲苯是一种对细胞生长有毒害作用的有机溶剂，虽然在低浓度情况下，木醋杆菌对有机溶剂有一定的耐受性，但是浓度提高后，超过菌体的耐受性，其会对菌体产生毒害作用，导致菌体大量死亡。

2.3 超声波对BC产量的影响

超声波的空化作用和机械作用可增加细胞膜的通透性，使细胞膜发生可以修复的损伤，从而使细胞内的物质释放到细胞外。以体积分数6%的接种量接入液体培养基中，30℃下培养24 h后，在一定超声功率、频率条件下，分别处理30 s、60 s、90 s、120 s，继续培养3 d。考察超声波对木醋杆菌生物合成BC的影响，结果如图3所示。

图3 不同超声时间对BC产量的影响

由图3可知，超声波对木醋杆菌生物合成BC具有轻微的促进作用。菌体生长1 d后，采用超声处理时间为60 s时，BC的产量达到6.31 g/L，是对照组的1.08倍。继续增加超声处理时间，BC产量不再继续增加。这表明适度的超声波处理，可促进木醋杆菌合成BC。但是处理时间超过60 s，会导致木醋杆菌细胞的破碎，镜检结果见图4。该试验结果与邓毛程等的研究结果相似。

图4 超声处理对木醋杆菌菌体的影响

3 结 论

采用化学法（吐温-80和有机溶剂）和物理法（超声波）处理木醋杆菌细胞，对BC的合成及菌体生长的均有影响。

a）吐温-80的添加量增至0.04%，BC的产量是对照组的1.23倍，但是菌体量下降了11.6%。这说明吐温-80一方面可以促进BC的合成，另一方面能对菌体细胞产生损伤作用。

b） 采用有机溶剂（丙酮、氯仿和甲苯） 处理木醋杆菌细胞，当添加量为0.05%时，对BC的合成均有轻微的促进作用。继续增加有机溶剂添加量，特别是毒性较大的氯仿和甲苯，能导致BC和菌体量急剧下降，这说明氯仿和甲苯会对细胞造成大的损伤。

c） 采用超声波清洗机超声处理达到60 s时，BC产量是对照组的1.08倍。超声处理超过60 s后，BC产量不再增加，镜检可看到菌体碎片。这说明适度的超声可以促进BC的合成，超声时间过长会导致菌体破碎。

［1］ROSS P，MAYER R，BEBZIMAN M.Cellulose biosynthesis and function in bacteria［J］.Microbiological Reviews，1991，55（1）：35-58.

［2］YOSHINAGA F，TONOUCHIN，WATANABEK.Research progress in production of bacterial cellulose by aeration and agitation culture and its application as a new industrial material［J］.Biosci.Biochem，1997，61（2）：219-224.

［3］刘晓艳，丘秦球，黄卓烈.不同方法对酵母细胞膜通透性的影响［J］.华南农业大学报，2004，25（1）：74-76.

［4］邓毛程，吴亚丽.表面活性剂对木醋杆菌产细菌纤维素的影响［J］.食品研究与开发，2008，29（7）：32-34.

［5］邓毛程，吴亚丽，梁世中.超声波促进高纤椰果发酵的研究［J］.食品与发酵工业，2008，34（3）：62-65.

［6］WEIHUA T，SHIRU J，YUANYUAN J，etal.The influence of fermentation conditions and post-treatmentmethods on porosity of bacterial cellulose［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26：125-131.

［7］GEORGE J，SAJEEVKUMARV A，KUMARR.Enhancement of thermal stability associated with the chemical treatmentof bacterial（Gluconacetobcter xylinus）cellulose［J］.Journal of Applied Polymer，2008，108（3）：1845-1851.

［8］王庆利，何丹，郑晓冬，等.有机溶剂对细胞的毒害及细胞的耐受性机制［J］.微生物学通报，2002，29（4）：81-85.

［9］刘晓艳，丘秦球，刘石生.超声对细胞膜通透性的影响及应用［J］.应用声学，2002，21（2）：26-29.

Effect of cellmembrane permeability on yield of bacteria cellulose produced by acetobacter xylinum

TANG Weihua1*JIA Shiru2

1（Department of Biological Engineering,Tianjin Modern Vocational Technology College,Tianjin 300350，China）

2（Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory,Tianjin 300457，China）

细菌纤维素（Bacterial cellulose，BC）是由微生物产生的一类纯纤维素。采用化学法（表面活性剂和有机溶剂）和物理法（超声波）改变细胞膜的通透性，旨在提高BC的产量。试验结果表明，当吐温-80的添加量达到4.0%（v/v）时，BC的产量是对照组的1.23倍；有机溶剂（丙酮、甲苯和氯仿）对BC的合成无明显的促进作用，当氯仿和甲苯添加量分别增至3.0%和1.5%时，菌体量和BC产量均降至0；适度的超声处理可促进BC的合成，当超声处理时间为60 s时，BC是对照组的1.08倍。

木醋杆菌；细菌纤维素；有机溶剂；超声波；吐温-80

The bacterial cellulose is a kind ofhigh puritycellulose produced bymicroorganism.The permeabilityofcell membrane was changed bychemical method(surface active agent and organic solvent)and physical method(ultrasonic),which was aimed to increase the yield of bacterial cellulose.The results showed that,the yield of bacterial cellulose was 1.23timesofthecontrolgroupastheamountoftween-80 was4%(v/v).Organicsolvents(acetone,tolueneand chloroform)had nosignificant effect on the synthesis ofbacterial cellulose.When the amount ofchloroformand toluene was increased to 3%and 1.5%respectively,the biomass and the yield of bacterial cellulose decreased to 0.Appropriate ultrasound treatment can promote the synthesis ofbacterial cellulose,when the ultrasonic treatment time is 60 s,BCis 1.08 times of thecontrolgroup.

acetobacter xylinum；bacterial cellulose；organic solvent；ultrasonic；tween-80

TS261.1+3

A

1673-6044（2017）01-0013-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.01.006

*汤卫华，女，1979年出生，2009年毕业于天津科技大学发酵工程专业，教授。

2016-09-01