肾综合征出血热患者发热期淋巴细胞亚群和病毒载量的研究

刘艳飞　朱元祺　郑红英

【摘要】 目的 探讨青岛市肾综合征出血热（HFRS）患者发热期淋巴细胞亚群和病毒载量的变化特点。方法 25例HFRS发热期患者设为HFRS发热期组， 30例无偿献血者设为正常对照组。通过胶体金法检测HFRS发热期组的汉坦病毒免疫球蛋白M（IgM）抗体；通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）和流式细胞仪测定两组的淋巴细胞亚群和病毒载量。结果 HFRS发热期组血清中IgM抗体阳性， 其病毒载量为（69.8±27.4）copies/μl。HFRS发热期组总T细胞（CD3+）和T抑制/细胞毒细胞亚群（CD3+CD8+）百分比显著高于正常对照组， T辅助/诱导细胞亚群（CD3+CD4+）百分比和CD4/CD8 T细胞比值（CD4+/CD8+）及自然杀伤细胞（CD16+56+）百分比明显低于正常对照组， 差异有统计学意义（P<0.01）， 但B细胞（CD3-CD19+）百分比与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 总T细胞和T抑制/细胞毒细胞亚群百分比增高有利于HFRS患者早期的免疫应答。

【关键词】 肾综合征出血热；汉坦病毒；淋巴细胞亚群；病毒载量

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.28.008

【Abstract】 Objective To investigate the change characteristics of lymphocyte subsets and viral load in hemorrhagic fever with renal syndrome （HFRS） patients during fever period. Methods There were 25 pyretogenic stage of HFRS patients as HFRS fever group， and 30 unpaid blood donors as normal control group. The Hantaan virus immunoglobulin M （IgM） antibody was detected by colloidal gold method in the HFRS fever group. The lymphocyte subsets and viral load of the two groups were determined by fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） and flow cytometry. Results HFRS fever group had all positive serum IgM antibody， with viral load as （69.8±27.4） copies/μl. HFRS fever group had obviously higher percentages of total T cell （CD3+） and T suppressor / cytotoxic subpopulation （CD3+CD8+） than normal control group， and obviously lower percentages of T helper / inducer cell subsets （CD3+CD4+） and CD4/CD8T cell ratio （CD4+/CD8+） and natural killer cells （CD16+56+） than normal control group. Their difference was statistically significant （P<0.01）. But there was no statistically significant difference in percentage of B cells （CD3-CD19+） comparing with normal control group （P>0.05）. Conclusion The increase in percentage of total T cell and T inhibition / cytotoxic cell subsets is favorable for early immune response in HFRS patients.

【Key words】 Hemorrhagic fever with renal syndrome； Hantaan virus； Lymphocyte subsets； Viral load

流行性HFRS是青島市周边区、市的地方性自然疫源性传染病。该病由汉坦病毒引起， 病情重， 死亡率高。典型病例表现为发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过[1]。据Sadeghi等[2]报道， 发热、腰痛和头痛是最主要症状， 各占85.9%、62.5%和54.7%。早发现、早诊断和早治疗对于患者的预后非常重要， 而发热期又对该病的早期诊断有重要的价值。因此， 作者通过荧光定量PCR 和流式细胞仪对青岛市HFRS患者发热期淋巴细胞亚群和病毒载量进行检测， 以探讨其变化特点和对临床早期诊断的价值。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2013年1月～2016年12月就诊的25例HFRS发热期患者， 将其设为HFRS发热期组， 依据中华人民共和国卫生行业标准WS278-2008诊断为流行性HFRS。HFRS发热期组患者年龄10～71岁， 平均年龄（45±18）岁；其中男15 例， 女10例。选取30例无偿献血者设为正常对照组， 年龄12～68岁， 平均年龄（39±11）岁；其中男18例， 女12例。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。endprint

1. 2 仪器和主要试剂 罗氏公司Cobas480型PCR扩增仪；上海之江生物有限公司提供病毒核糖核酸提取和荧光PCR扩增试剂盒。汉坦病毒IgM和IgG抗体试剂盒由厦门波生生物技术有限公司提供。美国BECKMAN COUITER FC 500型流式细胞仪及其配套试剂。其他常用试剂为国产厂家提供。

1. 3 汉坦病毒抗体检测、核酸提取和病毒载量测定 采用胶体金法测定血清汉坦病毒IgM抗体， 具体操作步骤按厂家提供的说明书进行。病毒核糖核酸提取按照上海之江公司提供试剂盒的说明书操作， 然后保存于-80℃备用。病毒载量测定根据数据库中汉坦病毒M14627序列设计引物， 参照上海之江公司提供试剂盒的说明书进行改良。

1. 4 淋巴细胞亚群的测定 淋巴细胞亚群的测定步骤：①取4支流式检测专用小试管， 标号， 加抗体和样本染色： 45-4-8-3抗体4 ?l， 3-16-56抗体8 ?l， 19-3DR抗体4 ?l和8 ?l，

4-25抗体8 ?l。②加颠倒混匀全血40 ?l， 振荡混匀， 避光20 min。③加溶血素200 ?l， 振荡混匀， 避光10 min。④观察溶血情况， 溶血良好， 250 g/rpm， 离心5 min， 弃上清；加2 ml鞘液， 250 g/rpm离心5 min， 弃上清；加鞘液0.5 ml， 上机获取。

1. 5 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 汉坦病毒抗体和病毒载量测定结果 HFRS发热期组患者血清IgM抗体全部阳性。而且经荧光PCR扩增， 全部为阳性结果， 其病毒载量为（69.8±27.4）copies/μl。

2. 2 两组淋巴细胞亚群比较 HFRS发热期组CD3+和CD3+CD8+百分比显著高于正常对照组， CD3+CD4+百分比和CD4+/CD8+及CD16+56+百分比明显低于正常对照组， 差异有统计学意义（P<0.01）， 但CD3-CD19+百分比与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

目前， 人感染HFRS病毒亚型主要是汉滩型（Hantaan virus， HTN）和汉城型（Seoul virus ， SEO）[3， 4]。我国曾把HTN 和SEO病毒称为“野鼠型”和“家鼠型”病毒， 现已将“野鼠型”改为“姬鼠型”[5]。青岛市流行性HFRS具有地方性特点， 主要分布在周围区、市。尽管由于加强灭鼠和疫苗接种等预防措施以及农村人口城市化， 使发病率下降， 但每年都有患者就诊。在疾病的早期， 针对病毒的免疫应答， 机体可产生IgM抗体， 并可检测到病毒RNA。作者的研究结果显示， 25例HFRS发热期患者血清IgM抗体全部阳性， 且经荧光PCR扩增， 也全部为阳性结果， 其病毒载量为（69.8±27.4）copies/μl。

因此， 早期检测这两个指标， 对临床的早期诊断具有十分重要的意义。

病毒感染后， 可引起机体的免疫应答和释放细胞因子， 导致小血管和毛细血管损害为主的病理改变[6]。本次研究结果显示， 在HFRS患者发热期， CD3+CD4+百分比和CD4+/CD8+低于正常对照组（P<0.01）， CD3+CD8+百分比高于正常对照组（P<0.01）， 这与温丽丽等[7]的报道相一致。但是， CD3+百分比高于正常对照组（P<0.01）， 与温丽丽等[7]的报道不同， 这是否与病毒感染的类型、患者的年龄、测定方法等因素有关， 需要进一步研究。CD16+56+百分比低于正常对照组（P<0.01）， 这与邵凤娟等[8]的报道一致， 但CD3-CD19+百分比与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。尽管不同的研究结果会有差异， 但CD3+CD4+百分比降低和CD3+CD8+百分比增高是所有报道的共同点， 这表明在感染的早期淋巴细胞亚群参与了机体的体液和细胞免疫反应[9， 10]。

综上所述， 对HFRS患者发热期病毒抗体和病毒载量进行检测， 对早期诊断具有价值。淋巴细胞亚群不同的变化， 提示在诊治过程中对体液和细胞免疫反应进行干预和调节， 这将有助于提高对患者的治疗效果。

参考文献

[1] 王玉兰， 蔡东， 许艳， 等. 日照平原地区鼠类及其携带汉坦病毒调查. 中国国境卫生检疫杂志， 2016（6）：417-419.

[2] Sadeghi M， Eckerle I， Daniel V， et al. Cytokine expression during early and late phase of acute Puumala hantavirus infection. BMC Immunol， 2011， 12（1）：65.

[3] Hu T， Fan Q， Hu X， et al.Molecular and serological evidence for Seoul virus in rats （Rattus norvegicus） in Zhangmu， Tibet， China.Arch Virol， 2015， 160（5）：1353-1357.

[4] Ma Y， Yuan B， Zhuang R， et al. Hantaan Virus Infection Induces Both Th1 and ThGranzyme B+ Cell Immune Responses That Associated with Viral Control and Clinical Outcome in Humans. Plos Pathogens， 2015， 11（4）：e1004788.

[5] 王麗娜， 韩增磊， 李晓斐. 肾综合征出血热患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及意义. 检验医学， 2015， 30（1）：58-60.

[6] 易静. 肾综合征出血热患者血浆病毒载量的检测及其与病程病情关系的研究. 第四军医大学， 2012.

[7] 温丽丽， 李金明. 流行性出血热发热期外周血T淋巴细胞亚群与血小板的检测. 实验与检验医学， 2013， 31（4）：326-327.

[8] 邵凤娟， 朱思和， 马英骥， 等. 肾综合征出血热患者sIL-2R和淋巴细胞亚群的变化. 中华传染病杂志， 2002， 20（6）：349-352.

[9] 刘蓓. 肾综合征出血热患者CD100表达的变化规律及其与疾病的关系. 第四军医大学， 2013.

[10] 陈耀锋， 王雅格. 血浆病毒载量检测在肾综合征出血热诊断中的作用研究. 国际病毒学杂志， 2015， 22（2）：108-111.

[收稿日期：2017-08-08]endprint