酶在普洱茶膏加工工艺中的应用

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(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

酶在普洱茶膏加工工艺中的应用

潘斐,刘通讯*

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

本文以氨基酸、茶多糖、茶多酚含量变化为指标,研究不同酶处理对普洱茶膏中呈味物质含量的影响,优化酶的作用条件,并对优化后的茶膏进行感官评定。结果表明:在相同酶浓度条件下,风味蛋白酶水解茶叶蛋白能力显著强于中性蛋白酶(p<0.01),在两种酶添加量都为45 U/g时,茶汤氨基酸增长率都达到最高,分别为28.49%、15.19%;在复配蛋白酶浓度为27 U/g,中性蛋白酶与风味蛋白酶比例为1∶2时,两种蛋白酶协同效果最佳,极显著高于同浓度单一酶作用效果(p<0.01),茶汤氨基酸增长率达到22.07%;不同糖酶水解茶叶糖类能力强弱排序为:植物水解酶>果胶酶>纤维素酶,三者差异显著(p<0.05),在植物水解酶添加量为0.6%时,茶汤中茶多糖增长率高达82.45%;多酚氧化酶对茶汤中茶多酚的转化影响很小,茶汤中茶多酚下降范围在0.32%至4.55%。优化后的茶膏感官品质有了较大提升,优化工艺合理、可行。

普洱,茶膏,蛋白酶,糖酶,多酚氧化酶

普洱茶膏是将普洱茶中营养物质及一些药用成分提取出来,制成膏体的形状,使它脱离了茶叶原有的外观形态的一种特殊的固体速溶茶[1]。速溶茶普遍存在滋味淡薄苦涩、茶汤浑浊、香气不足等问题,茶叶中内源酶已经不能满足现代茶叶深加工需求,为了提高茶叶品质,国内外许多学者在茶叶加工过程中添加了外源酶,研究较多的主要有多酚氧化酶、单宁酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶等。

茶叶中蛋白质溶解性较差,蛋白酶可以把蛋白质水解成小分子氨基酸,提高茶汤鲜爽度,又能提高茶叶蛋白质的利用率[2]。纤维素酶及果胶酶分解茶叶细胞壁,破坏细胞结构,从而提高茶汤中可溶性糖的含量,增进茶汤甜醇度[3]。多酚氧化酶促进儿茶素类物质氧化形成茶色素和其他的氧化聚合物,形成熟普特有的滋味与香气[4]。目前,关于茶膏工艺的研究比较少,大部分研究以得率及感官评价为依据选择工艺条件,没有考察茶膏中特征物质的含量[5-6]。部分学者将高温高压技术、热回流技术、真空浓缩技术应用于茶膏提取加工工艺,有效提高了茶膏的感官品质[7-8]。谭超[9]和杨柳[10]将酶技术应用于茶膏加工工艺,但没有对酶的作用条件进行优化。本文在前文对茶膏工艺优化的基础上[11],选择了两种蛋白酶、三种糖酶及多酚氧化酶对普洱茶膏加工做了进一步研究,以期筛选出合适的外源酶种类及其最优作用条件,为普洱茶膏加工提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

大叶种晒青毛茶(普洱生茶) 云南腾冲,2011年;一级普洱茶膏 蒙顿茶制品有限公司;中性蛋白酶:0.8 AU-N/g、风味蛋白酶:1000 LAPU/g、纤维素酶:700 EGU/g、植物水解酶:100 FBG/g 诺维信(中国)生物技术有限公司;果胶酶:50 U/g 国药集团化学试剂有限公司;多酚氧化酶:570 U/mg 美国Worthington 生物化学公司。

ESJ200-4电子分析天平 上海精科电子有限公司;UV752N型分光光度计 上海棱光技术有限公司;富华420型三用水箱 金坛市富华仪器有限公司;DHG90A 电热恒温鼓风干燥箱 上海索普仪器有限公司;循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2实验方法

1.2.1 茶膏制作工艺流程 使用前文[5]优化的条件作为普洱茶膏加工方法:普洱生茶及蒸馏水(茶水比1∶20)→80 ℃水浴浸提→冷却→初始提取液(1)→100 μm滤布过滤→80 μm滤布过滤→初始提取液(2)→100 ℃水浴浓缩→40 ℃干燥→茶膏

其中,初始提取液(1)为未过滤液体,初始提取液(2)为过滤液。

1.2.2 蛋白酶种类筛选及其作用条件优化 本实验选择中性蛋白酶和风味蛋白酶两种酶进行研究,中性蛋白酶属于内切酶,其最适pH在6.5～8.5之间,风味蛋白酶主酶为外切酶,含有少量内切酶,其最适pH在5～7之间,两者最适pH与茶汤pH(5.5～7)接近,无需对茶汤pH进行调整,不会影响茶汤口感。

实验方法为:在初始提取液(1)中加入不同蛋白酶,按照两种酶的最适作用温度50 ℃进行酶解,分别考察不同酶浓度(18、27、36、45、54 U/g)及不同作用时间(3、6、9、12 h)对茶汤氨基酸含量的影响。

1.2.3 蛋白酶复配作用条件优化 根据蛋白酶作用条件的实验结果,对两种蛋白酶进行复配。将复配酶加入初始提取液(1),考察复配酶对茶汤氨基酸的影响,复配方法见表1。

表1 蛋白酶复配表Table 1 Different combination of proteases

1.2.4 糖酶种类筛选及其作用条件优化 本实验选择了降解茶叶细胞壁的纤维素酶、果胶酶进行研究,另外,选取了一种在茶叶提取中应用较多的植物水解酶进行研究。

实验方法为:在初始提取液(1)中加入不同糖酶,按照其最适作用温度,纤维素酶在65 ℃进行酶解,果胶酶及植物水解酶在50 ℃进行酶解,分别考察不同酶浓度(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)及不同作用时间(2、4、6、8 h)对总糖含量的影响。

1.2.5 多酚氧化酶作用条件优化 本实验所使用的多酚氧化酶最适pH为6.5,最适作用温度为25 ℃,茶汤本身pH为5.5。

实验方法为:在初始提取液(2)加入多酚氧化酶,在25 ℃进行反应,分别考察不同酶浓度(5、20、80、320、1280 U/mL)、不同作用时间(30、60、90、120 min)及不同pH条件(6.5、5.5)对茶多酚含量的影响。

1.2.6 理化成分分析方法 游离氨基酸总量测定:GB/T 8314-2013;茶多糖含量测定:参照Lin 等[12]的苯酚-硫酸法;茶多酚含量测定:GB/T 8313-2008;蛋白酶活性测定:GB/T 23527-2009;纤维素酶、果胶酶、植物水解酶活性测定:聚半乳糖醛酸酶活力法[3]、滤纸酶活力法[13];多酚氧化酶活性测定:邻苯二酚比色法[14];茶色素总量测定:比色系统分析法[14]。

1.2.7 感官评价方法 评分采用百分制[15],以市面上一级普洱茶膏作为对照样(100分),茶膏外形10分、汤色20分、香气35分、滋味35分,由15名专业评茶师进行密码感官审评打分,并根据品质特性给予相应的评语,评茶术语参照DB 53/T 103-2006《普洱茶》、GB/T 14487-2008《茶叶感官审评术语》。

1.2.8 变化率计算方法 在酶作用前和酶作用后(100 ℃灭酶5 min)分别对茶多酚、氨基酸、茶多糖及茶色素的含量进行测定,各物质变化率计算方法如下:

变化率(%)=(A-B)/B×100

式(1)

式(1)中,A表示酶作用后茶汤中物质质量(mg);B表示酶作用前茶汤中物质质量(mg)。

1.2.9 酶添加量计算方法

酶添加量=A/B

式(2)

式(2)中,A表示蛋白酶、多酚氧化酶酶活力(U)或纤维素酶、果胶酶、植物水解酶质量(g);B表示茶叶质量(g)。由于纤维素酶、果胶酶、植物水解酶的酶活力代表的含义不同,为便于三者进行比较,以质量浓度表示酶添加量。

1.3数据统计与分析

2 结果与分析

2.1蛋白酶在普洱茶膏加工工艺中的应用研究

2.1.1 不同蛋白酶对茶汤游离氨基酸含量的影响 茶叶中蛋白质的含量约为22%[16],由谷蛋白、白蛋白、球蛋白、精蛋白等组成,其中1%～2%蛋白质能溶于水,它们在茶汤中呈胶体状态,对茶汤的清亮及稳定性起重要作用。图1A反映了不同浓度蛋白酶水解茶汤6 h后茶汤游离氨基酸的变化,图1B反映了蛋白酶添加量为45 U/g时,不同水解时间对茶汤游离氨基酸的影响。

图1 蛋白酶添加量和作用时间对游离氨基酸含量的影响Fig.1 Effect of enzyme dosage and hydrolytic timeon content of free amino acid注:图中英文大、小写字母分别表示Duncan’s新复极差测验(SSR法)在0.01、0.05水平下的差异显著性,字母不同表示差异显著,反之不显著(n=3)。图2、图3同。

未添加酶之前,茶汤中游离氨基酸为1.22 mg/mL。由图1A可知,添加风味蛋白酶和中性蛋白酶后,茶汤中游离氨基酸含量分别增长18.36%～28.49%和13.18%～15.19%,可以看出,在相同酶浓度条件下,风味蛋白酶对茶叶蛋白的水解作用显著优于中性蛋白酶(p<0.01)。中性蛋白酶属于内切酶,主要作用方式是水解蛋白质内部肽键,风味蛋白酶主酶为外切酶,含有少量内切酶,主要是通过N端肽键水解作用释放氨基酸,茶叶蛋白可能更适合外切酶的作用方式,也可能是风味蛋白酶的内切酶、外切酶的复配增强了其水解效果。另外,茶汤pH(5.5～7)更接近风味蛋白酶的最适作用pH(5～7)也是风味蛋白酶水解效果更好的原因之一。被蛋白酶水解的茶叶蛋白既有可溶性蛋白,也有非可溶性蛋白,研究表明,大多数被分解的蛋白为非水溶性蛋白[17]。随着酶浓度的增加,两种蛋白酶水解作用不断增强,同时在酶添加量为45 U/g时达到最强。

从图1B可以看出,随着蛋白酶作用时间增加,氨基酸增长率先增后降,作用时间为6 h时增长率达到最高,由此可知,茶叶中蛋白质需要较长时间才能水解完全,超过6 h后,游离氨基酸增长率慢慢下降,一方面原因是蛋白酶在长时间的加热作用下,酶活力会慢慢下降[18],另一方面原因是在长时间的加热作用下,氨基酸会慢慢转化为其他物质,可能发生的反应是Maillard反应,也可能是氨基酸与多酚类物质聚合生成不同分子量的聚合物[19]。可以看出,两种蛋白酶最佳作用时间都为6 h。

2.1.2 蛋白酶复配对茶汤氨基酸含量的影响 不同蛋白酶对茶叶蛋白的酶切位点不同,两种蛋白酶结合使用后,酶切位点相互补充,从而能生成更多小分子肽段和游离氨基酸[20]。图2反映了在酶解时间为6 h的条件下,不同配比及浓度的蛋白复配酶对茶汤游离氨基酸的影响。

图2 中性蛋白酶和风味蛋白酶的不同浓度配比对氨基酸含量的影响Fig.2 Effect of different concentration ratio ofneutrase and flavourzyme on content of amino acid注:比例表示中性蛋白酶:风味蛋白酶。

由图2可知,中性蛋白酶和风味蛋白酶复配之后,游离氨基酸含量增长范围为16.19%～22.07%,总体来看,复配酶效果比单一中性蛋白酶好,而比单一风味蛋白酶差。在复配酶添加量为27 U/g时,游离氨基酸含量增长率范围为20.44%～22.07%,单独使用27 U/g风味蛋白酶时,游离氨基酸增长率为18.54%,由此可知,在蛋白酶浓度为27 U/g时,复配酶效果优于单独使用两种酶,这可能是由于两种蛋白酶酶切位点互相补充导致的协同效应。在复配酶添加量分别为36 U/g和45 U/g时,游离氨基酸含量增长率范围分别为19.44%～20.98%和21.34%～22.07%,而风味蛋白酶在同样添加量下,游离氨基酸含量增长率分别为23.60%和28.49%,可以明显看出,在酶添加量为36 U/g和45 U/g的条件下,复配酶的协同效应相对较弱。

2.1.3 蛋白酶对普洱茶膏感官品质的影响 对经不同酶作用的茶膏样品进行感官分析,结果见表2。由表2可知,经45 U/g风味蛋白酶优化后的茶膏茶汤较无酶组滋味更鲜爽,苦涩味降低,刺激性减小,感官评分较高。这可能是因为茶叶蛋白质经酶解后,分子量变小,生成的小分子肽或氨基酸很容易进入舌头味蕾孔口刺激味细胞产生滋味,且大多数茶叶氨基酸具有鲜爽的滋味,能够一定程度上遮盖茶多酚的苦涩滋味[18]。

表2 不同酶作用条件制成茶膏的感官分析Table 2 Sensory assessment of pu-erh tea cream produced by different enzymic treatments

2.2糖酶在普洱茶膏加工工艺中的应用研究

2.2.1 不同糖酶对茶汤茶多糖含量的影响 茶叶中多糖类化合物占茶叶干物重的25%～30%,主要以三种形态存在,一种是游离态,是水溶性的,如葡萄糖等;第二种是结合态,必须经过某些水解酶作用,水解为可溶性糖;第三种是不溶性的,如纤维素、木质素、果胶等[16]。其中,水溶性多糖只占茶叶干物重的0.5%～3%左右,糖酶可水解茶叶中结合态糖及不溶性糖,提高茶叶中多糖类物质利用率。另外,在一般的水浸提条件下,茶叶中活性成分由于被纤维素、果胶等为主体的细胞壁所包围,它们的扩散和浸出受到阻碍,因此速溶茶普遍存在滋味淡、香气低等缺点,利用糖酶可破坏茶叶细胞壁,促使茶叶细胞中有效成分溶出。图3A反映了不同浓度糖酶水解茶汤2 h后茶汤茶多糖增长率的变化,图3B反映了糖酶(0.6%纤维素酶,0.8%果胶酶,0.6%植物水解酶)的不同作用时间对茶汤茶多糖增长率的影响。

图3 糖酶添加量和作用时间对茶多糖含量的影响Fig.3 Effect of enzyme dosageand hydrolytic time on content of polysaccharide

未添加酶之前,茶汤中茶多糖为0.95 mg/mL。由图3A可知,在糖酶作用时间为2 h时,纤维素酶的茶多糖增长率范围为1.7%～28.26%,果胶酶的茶多糖增长率范围为4.04%～45.69%,植物水解酶的茶多糖增长率范围为15.72%～82.45%,可以看出,不同糖酶水解茶叶糖类能力强弱排序为:植物水解酶>果胶酶>纤维素酶,三者差异显著(p<0.05),这与龚玉雷[3]的研究结果一致。三种糖酶都为复合酶,纤维素酶是降解纤维生成葡萄糖的一组酶的总称,由许多具有高协同作用的多组分水解酶组成;果胶酶是一类分解果胶的酶的总称,包括聚半乳糖醛酸酶等,是含有多种组分的复合酶;植物水解酶酶系组成较为复杂,主要由聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和纤维素酶等构成[20]。本研究经检测发现,纤维素酶的滤纸酶活力较高,其聚半乳糖醛酸酶活力很小,可忽略不计,果胶酶的聚半乳糖醛酸酶活力较高,其滤纸酶活很小,可忽略不计,植物水解酶两种酶活力都较高,其聚半乳糖醛酸酶活力与滤纸酶活力的比值约为70。由此可知,相比纤维素酶,果胶酶可能更适合水解茶叶多糖体系,这可能与聚半乳糖醛酸酶的作用有关。而植物水解酶可能是由于同时含有聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶,且各酶系之间协同作用强,能更有效地水解细胞壁多糖,促进茶叶内含物的释放。

随着糖酶浓度增加,茶多糖增长率均先升后降,纤维素酶和植物水解酶在酶浓度为0.6%时达到最高增长率,果胶酶在0.8%时达到最高增长率,超过最佳浓度后,茶多糖增长率渐渐下降。这可能是因为高浓度条件下,酶与底物易结合形成络合物对酶形成反馈抑制,也可能是高浓度酶影响了茶多糖的溶出与扩散。由图3B可知,糖酶作用最佳时间均为2 h,超过2 h后,茶多糖增长率渐渐下降,超过4 h后,茶多糖含量下降加快,低于添加酶之前的含量,呈现负增长,这可能是由于茶多糖热稳定性较差,长时间加热分解速度加快,也可能是在高温作用下参与到非酶促褐变反应中,生成相应的醛类和吡咯类、吡嗪类等含氮化合物[21]。

2.2.2 糖酶对茶膏感官品质的影响 由表2可知,经0.6%植物水解酶优化后的茶膏茶汤口感甜醇有回甘,香气较好,且茶汤澄清度得分较高,总体评分高于风味蛋白酶组。普洱生茶茶多酚含量较高,滋味较苦涩,利用糖酶提高茶汤中茶多糖的含量,有利于形成甜醇的滋味,减少茶多酚的刺激感,改善茶汤口感,且茶多糖是一类具有生理活性的大分子天然产物,具有多种保健功效,如降血糖、降血脂、增强免疫力等[22]。

2.3多酚氧化酶在普洱茶膏加工工艺中的应用研究

2.3.1 多酚氧化酶对茶汤茶多酚含量的影响 茶多酚是茶叶中多酚类衍生物的总称,具有很强的抗氧化作用,且收敛性强,具有较强的涩味,是构成茶汤苦涩、回甘生津的主要物质[23]。普洱生茶中茶多酚含量较高,因此普洱生茶的口感较其他茶类更为苦涩。在多酚氧化酶的作用下,多酚类中的没食子儿茶素及其没食子酸酯会氧化为邻醌,再逐步氧化缩合,生成刺激性较弱的茶黄素、茶红素,并进一步氧化聚合生成茶褐素,在这一过程中,茶汤滋味会由苦涩渐渐变得醇和[24-25]。图4A展示了不同浓度多酚氧化酶作用茶汤30 min后茶多酚含量的变化,图4B展示了在多酚氧化酶添加量为320 U/mL时,不同作用时间对茶多酚含量的影响。

图4 多酚氧化酶添加量和作用时间对茶多酚含量的影响Fig.4 Effect of enzyme dosageand hydrolytic time on content of tea polyphenol

未添加酶之前,茶汤中茶多酚为9.11 mg/mL。由图4A可知,茶汤茶多酚含量下降率范围在4.55%至0.32%,可以看出,茶多酚含量变化率不大,且检测发现茶色素含量也几乎没有变化,这可能是由于茶汤体系与渥堆发酵体系差异较大。在渥堆发酵时,发生的反应主要有湿热反应、微生物代谢及茶叶胞内酶与微生物胞外酶进行的酶促氧化反应等[26]。在两个pH条件下,茶多酚含量变化差异不明显,在多酚氧化酶最适pH条件下,茶多酚含量下降得稍多。在多酚氧化酶浓度为320 U/mL时,茶多酚下降了4%,随着酶浓度增加,茶汤中茶多酚含量渐渐趋于平稳。由图4B可知,反应时间为60 min时,茶多酚下降达到最高值。

2.3.2 多酚氧化酶对茶膏感官品质的影响 由表2可知,经多酚氧化酶处理后的茶膏风味与不经酶处理的区别不大,主要是因为多酚氧化酶在茶汤体系中氧化作用不强,茶汤中主要呈味物质含量变化较小。总体来看,多酚氧化酶对茶汤茶多酚的转化影响小,且多酚氧化酶价格高昂,综合考虑,多酚氧化酶不适用于茶膏加工。

3 结论

普洱茶膏是从中国古代流传下来的一种速溶茶,本研究表明,应用蛋白酶和糖酶能分别有效提高茶汤中氨基酸、茶多糖含量,增强茶汤特定风味。对于同一类酶,不同来源、不同性质的酶由于水解位点不同,产生的小分子物质不同,因而水解后的茶汤具有不同的风味。本研究从五种酶中筛选出适合应用于现代普洱茶膏加工的两种酶,分别是风味蛋白酶和植物水解酶。风味蛋白酶的最佳作用条件为:酶添加量45 U/g,作用时间6 h。植物水解酶的最佳作用条件为:酶添加量0.6%,作用时间2 h。优化后茶膏的滋味、特征物质含量有了明显的提升,优化工艺合理、可行,能为现代普洱茶膏加工工艺提供参考,更好地传承与保护中国传统文化。

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ApplicationofenzymictreatmentontheprocessofPu-erhteacream

PANFei,LIUTong-xun*

(College of Food Science and Technology,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Based on the changes of contents of amino acids,tea polysaccharides and tea polyphenols,effects of different enzymatic treatments on the contents of major compounds in Pu-erh tea cream were studied,conditions of different enzymatic treatments were optimized and the sensory characteristics of different tea cream were evaluated. Results showed that in the same enzyme dosage,hydrolysis efficiency of flavourzyme was significantly higher than that of neutrase(p<0.01),under the condition of 45 U/g protease,the increase rate of amino acids was the highest,which were 28.49% and 15.19% respectively. Under the condition of 27 U/g complex proteases and proportion of 1∶2,two kinds of proteases had the best synergistic effect,which was higher than that of single enzyme(p<0.01)and the increase rate of amino acids was 22.07%. The ability of different carbohydrase to hydrolyze tea carbohydrates was ranked as follows:viscozyme>pectinase>cellulaste,and the difference among them was significant(p<0.05). Under the condition of 0.6% viscozyme,the increase rate of tea polysaccharides was 82.45%. Polyphenol oxidase had little effect on the transformation of tea polyphenols whose content decreased rate ranged from 0.32% to 4.55%. The quality of the optimized Pu-erh tea cream is better and the optimized process technology of Pu-erh tea cream is reasonable and feasible.

Pu-erh;tea cream;protease;carbohydrases;polyphenol oxidase

TS272.4

B

1002-0306(2017)19-0079-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.015

2017-03-03

潘斐(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：sunflower_fei@outlook.com。

*通讯作者:刘通讯(1965-)，男，博士，副教授，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：txliu@scut.edu.cn。