EMS对豇豆M2群体表型性状的变异分析

张忠武 孙信成 詹远华 柏秀芳 田 军 杨连勇 康 杰

EMS对豇豆M2群体表型性状的变异分析

张忠武 孙信成 詹远华 柏秀芳 田 军 杨连勇 康 杰

（常德市农林科学研究院蔬菜研究所，湖南常德 415000）

为了明确甲基磺酸乙酯（EMS）对豇豆的诱变效果及变异规律，以豇豆品种银豇王为试材，对EMS诱导的M2表型性状遗传变异进行了遗传力分析和聚类分析。结果表明：M2群体性状表现为始花期提前，始花节位降低，分枝数、有效花梗数和结荚数减少，荚条变长；从变异系数看，分枝数＞结荚数＞有效花梗数＞始花节位＞最大荚长＞平均荚长＞始花期；从广义遗传力看，分枝数的广义遗传力最高，达到88.7%，其次为有效花梗数和最大荚长；通过聚类分析，表型变异株占18.3%，其中长荚型材料比较常见，多荚型材料较少。

EMS；诱变；豇豆；表型性状；变异

植物诱变育种技术是指人为地利用物理诱变因子、化学诱变因子诱发植物产生遗传变异，然后根据实际的育种目标，经过多代人工定向选择、鉴定、选育植物新品种，同时获得有价值的植物突变新类型的一种育种方法，它是将常规育种方法与现代理化技术结合而成的现代育种技术（杨震 等，2016）。具有提高作物突变频率、扩大突变范围、改变农作物品种单一的不良性状、克服原有品种缺陷等诸多优点，突变性状通常稳定较快，因而缩短了育种周期，较快地提高作物品质。植物诱变技术包括辐射诱变、化学诱变、组织培养、病毒和反向遗传学操作等（于沐和周秋峰，2017）。甲基磺酸乙酯（EMS）是一种常用的化学诱变剂，能够诱发产生高密度的系列等位基因点突变（张敏 等，2011）。EMS所诱发的突变主要是鸟嘌呤G的N-7位置上被烷基化，使之成为带1个正电荷的季铵基团，第1位氨基上氢解离，使G不再与C配对而与T配对，从而造成G：C→A：T转换（刘根忠 等，2017）。EMS诱发突变技术已广泛应用于农作物诱变育种中（崔清志 等，2013；刘翔，2014），Feiz等（2009）利用EMS诱变技术创造了2 500株普通软质小麦突变体库，并推算每隔12 kb有1个突变发生，是目前报道突变频率最高的突变体库。在豆类作物中，前人通过EMS处理，先后育成了大豆（李占军 等，2005）、四棱豆（全妙华 等，2011）等新品种，也在花生中选出了高产株系（杨富军 等，2014）。

豇豆（Vigna unguiculata）属于豆科蝶形花亚科豇豆属，为一年生草本植物，在世界范围内种植广泛，主产国有尼日利亚、尼日尔、埃塞俄比亚、突尼斯、中国、印度、菲律宾等。随着新优品种的不断推广，配合育苗移栽、地膜覆盖、温室大棚等技术的广泛应用，豇豆的品质、产量均有了较大提高。但是，我国豇豆品种资源比较单一，品种间杂交和选育会导致豇豆遗传多样性下降和遗传资源枯竭，给以后的育种工作带来瓶颈效应（杨伟和王四清，2011）。前人在豇豆诱变育种方面取得了一定进展，李艳艳等（2015）通过秋水仙素诱导获得了豇豆四倍体，但EMS诱变技术在豇豆育种上的报道并不多见。为了探讨EMS诱导对豇豆的变异发生规律，本试验以银豇王为试材，对EMS诱导的M2表型性状遗传变异进行了遗传力分析和聚类分析，以期为豇豆诱变育种提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2016年3～10月在湖南省常德市农林科学研究院蔬菜研究所的科研基地进行。参试豇豆品种为银豇王，由湖南省常德天成种业有限责任公司育成，常德市农林科学研究院蔬菜研究所于2014年生产，冰柜保存。品种特性：植株蔓生，荚条银白色，长度55 cm左右，种皮红褐色，中熟，春季播种至开花45 d左右，夏秋季播种至开花35 d左右，适于长江流域及以南地区栽培。

1.2 试验方法

1.2.1 诱变处理 2016年春季用EMS处理豇豆种子：先用清水浸种4 h（常温18 ℃左右），再用0.9%EMS浸泡8 h，期间每隔30 min搅动1次，使诱变剂与种子均匀接触，处理后用0.1 mol·L-1Na2S2O3中和20 min，再用流动的自来水漂洗2 h，沥干水分后播种。

1.2.2 豇豆种植 用规格为54 cm×28 cm×5.5 cm的72孔塑料穴盘播种，每穴2粒，10 d后移栽到塑料大棚，观察M1的田间表现。夏季选择正常结荚株，将所产种子混合成M2混合群体。M2群体于2016年7月27日播种，漂浮育苗，8月1日移栽于网室大棚。高垄栽培，行距0.75 m（包沟），穴距30 cm，每穴2株，以原始亲本材料银豇王作对照（CK），3 次重复，总面积 180 m2，总株数 1 600 株。1.2.3 性状调查 田间随机取样，M2调查82株，对照调查18株。见花后调查始花期、始花节位，成熟期调查分枝数、有效花梗数、结荚数、最大荚长、平均荚长（王佩芝和李锡香，2006）。

始花期（d）：第1朵花的开放日距播种日的日历天数；始花节位（节）：从子叶节数起，主蔓上第1花序所在的节位；分枝数（个）：成熟期主茎上的一级分枝，不论结荚与否，分枝以长达2节以上为准；有效花梗数（个）：成功结荚的花梗总数；结荚数（个·株-1）：成熟期植株上的所有荚条数；最大荚长（cm）：豆荚生理成熟期取最长荚条，用钢卷尺测量荚条首尾两端的直线距离，弯荚则顺弯测量；平均荚长（cm）：达到商品成熟度以上的所有荚条的平均长度。

1.2.4 数据处理 试验数据采用SPSS 19软件进行统计分析（邓维斌 等，2012）。聚类分析采用系统聚类组间联接法，区间距离为欧式距离，标准化方式为Z得分，转换度量方式为绝对值。

1.2.5 性状变异的确定 变异判定方法根据SPSS 19软件生成的均值和标准差进行计算。

变异系数=标准差/均值×100%

均值差=处理均值-对照均值

均值增幅=均值差/对照均值×100%

广义遗传力=遗传方差/表型方差×100%

2 结果与分析

2.1 M1的性状表现

在M1中随机调查20株，EMS处理的豇豆始花期和单株结荚数均呈负向变异，平均提早2 d开花，结荚数减少1.48个·株-1；荚长呈正向变异，比对照长2.63 cm；而有效花梗数没有明显变化（表 1）。

表1 豇豆M1的表型性状比较

2.2 M2的表型性状统计

M27个表型性状的数据统计结果见表2，从均值来看，始花期、始花节位、分枝数、有效花梗数、结荚数呈负向变异，最大荚长和平均荚长呈正向变异。也就是说，M2主要表现为始花期提早，有效花梗数和结荚数减少，与M1表现一致；而且始花节位降低，分枝数减少，但荚条变长。

从变异系数看（表2），M2分枝数的变异系数最大，达到98.95%，其次为结荚数和有效花梗数，分别为43.59%和40.35%，而始花期、最大荚长、平均荚长的变异系数较小，仅在7.80%～8.45%之间。变异系数越大，表明在后代中发生基因分离和重组后产生的类型越丰富，发生的变异范围越大，同时也表明选择的潜力大，通过多代选择容易达到预期育种或创造新种质的目标（吴秀红，2011）。

从广义遗传力看（表2），分枝数的广义遗传力最高，达到88.7%，其次为有效花梗数和最大荚长，而平均荚长和始花节位的广义遗传力较低。广义遗传力较高表明其受环境影响较小，反之受环境影响较大。因此，对广义遗传力较高的性状如分枝数、有效花梗数等，可在早代进行选择。反之，广义遗传力较小的其他性状，因受环境影响较大，早代选择的效果较差，则适于在晚代选择。

2.3 M2群体的聚类分析

对M2的82个单株（1～120号）及原始亲本材料18个单株（226～250号）的表型性状通过标准化处理后，再进行系统聚类，得到单株的聚类树状图。由图1可知，在欧式距离为25时，可将100个单株聚类为2个类群，第Ⅰ类有99株，第Ⅱ类只有1株。而第Ⅰ类在距离为13左右处又分为A、B、C 3个类群，其中原始亲本材料有12株归为A类，5株为B类，1株为C类，A、B两类合计占94.4%，由此可将A、B两类划分为EMS处理前的性状类群，其他划为表型变异性状类群。在EMS处理的M282个单株中，A、B两类共计67株，占81.7%，划为表型无变异类群；其他15株则划分为表型变异类群，即表型变异株率为18.3%。

在15个表型变异株中，属于多荚型的有1株（67号），其花序数很多，结荚量也很大，综合性状较好，始花期36 d，始花节位为第8节，分枝数3个，有效花梗数20个，结荚数39个·株-1，最大荚长63 cm，平均荚长54 cm；属于长荚型的有14株。在长荚型中，平均荚长占优势的有4株（7、59、63、91号），最大荚长占优势的有10株（38、101、96、97、78、75、62、92、20、26号）。可见，在M2中荚条变长是其主要特点，但是也能发现多荚型单株，只是比率较小，遗传距离较远，属于值得关注的类型。

表2 豇豆M2主要表型性状的统计结果

3 结论与讨论

采用EMS诱导豇豆品种银豇王，M2的表型性状发生一定程度的变异，其中始花期、始花节位、分枝数、有效花梗数、结荚数呈负向变异，最大荚长和平均荚长呈正向变异，也就是说M2主要表现为始花期提早，始花节位降低，分枝数、有效花梗数和结荚数减少，荚条变长。从变异度和遗传力看，分枝数的变异系数最大，广义遗传力也最高，其次为有效花梗数，此两项有较大选择潜力，可作为早期筛选中重点关注的性状。根据M2的聚类分析，表型变异类群占比18.3%。表型变异类群中，长荚型材料比较常见，而多荚型材料相对较少，且是遗传距离最远的类型，值得关注。

研究表明，经EMS诱导后，番茄在M1发生育性下降，M2中不仅叶、花、果实、株型发生变异，而且有DNA的变化（杨建华 等，2014）；豇豆M1不仅种子发芽力下降（张忠武 等，2016），分枝数和结荚数也有变化（张忠武 等，2017）。本试验发现，银豇王经过EMS处理后，M2分枝数的变异系数最大，其他性状也有一定程度变异，与吴秀红（2012）在大豆上的研究结论一致。

虽然化学诱变产生有益突变的频率还不够高，且EMS诱变剂的点突变是相对细微的变化，但与遗传工程相结合，应用前景仍然广阔。本试验通过对EMS诱导的豇豆M2的表型变异分析，描述了表型性状的变异特征，其中荚条变长为主要特征，荚条增多也有发生，对豇豆化学诱变育种具有一定的指导意义。本试验对EMS处理后的豇豆M2表型性状进行了统计分析，但在DNA上是否表现为多态性，尚需检验。另外，在M2中表现为变异型的单株，是否在后代中具有一定的遗传稳定性，还有待于进一步研究。

图1 豇豆M2群体的聚类分析结果

崔清志，刘晓虹，陈惠明．2013．EMS诱变技术研究进展．湖南农业科学，（5）：7-9．

邓维斌，唐兴艳，胡大权，周玉敏．2012．SPSS 19（中文版）统计分析实用教程．北京：电子工业出版社．

李艳艳，周鸿章，户秋稳，杨阳，张蜀宁．2015．豇豆四倍体的诱导及鉴定．中国蔬菜，（1）：28-31．

李占军，魏玉昌，杜连恩．2005．大豆新品种化诱5号的选育及栽培技术．河北农业科学，9（2）：63-64．

刘根忠，王云飞，孟祥飞，张余洋，叶志彪．2017．EMS诱变的‘里格尔87-5’番茄M2群体突变体表型及其抗坏血酸研究．园艺学报，44（1）：120-130．

刘翔．2014．EMS诱变技术在植物育种中的研究进展．激光生物学报，23（3）：197-201．

全妙华，陈东明，蒋向辉．2011．四棱豆新品种湘棱豆3号的选育．中国蔬菜，（16）：112-114．

王佩芝，李锡香．2006．豇豆种质资源描述规范和数据标准．北京：中国农业出版社．

吴秀红．2011．春大豆EMS诱变M1、M2代主要农艺性状的遗传变异及相关性．大豆科学，30（5）：760-763．

吴秀红．2012．EMS对不同大豆品种M2代农艺性状的影响．农学学报，2（5）：29-31．

杨富军，王绍伦，高华援，刘海龙，周玉萍，李春洁，朱统国，孙晓苹，李晓伟．2014．不同基因型花生EMS诱变条件分析及突变系筛选．安徽农业科学，（33）：11778-11781．

杨建华，崔霞，常培培，李翠，李云洲，梁燕．2014．EMS诱变番茄自交系TTD302A的突变表型鉴定和分析．中国蔬菜，（4）：21-28．

杨伟，王四清．2011．襄阳市豇豆生产现状及发展思路．湖北农业科学，50（22）：4541-4543．

杨震，彭选明，彭伟正．2016．作物诱变育种研究进展．激光生物学报，25（4）：302-308．

于沐，周秋峰．2017．小麦诱发突变技术育种研究进展．生物技术通报，33（3）：45-51．

张敏，杨艳，康兆茹，李凌．2011．EMS诱变南高丛越橘及抗旱突变体的筛选．西南师范大学学报：自然科学版，36（3）：132-137．

张忠武，杨友伟，孙信成．2016．EMS处理对豇豆种子萌发的生理生化效应及EMS处理半致死剂量的研究．江汉大学学报：自然科学版，44（4）：305-310．

张忠武，孙信成，杨友伟，田军，杨连勇，詹远华，柏秀芳，刘峰．2017．EMS处理对豇豆生长发育的影响．热带作物学报，38（2）：1-7．

Feiz L，Martin J M，Giroux M J．2009．Creation and functional analysis of new puroindoline alleles in Triticum aestivum．Theoretical and Applied Genetics，118（2）：247-257．

Abstract：To clarify the mutagenic effect and variation rule of EMS on cowpea，this study took‘Yinjiangwang’ as tested material，and carried out genetic and cluster analysis on phenotypic traits in cowpea M2population induced by EMS. The results indicated that cowpea M2population showed the following changes：early flowering in advance，lower first flower position，decrease numbers of branch，effective pedicel and pod，elongate tender pod. The coefficient variation of agronomic characters was in sequence of branch number＞pod number＞effective pedicel numbers＞first flowering node＞maximum pod length＞average pod length＞flowering stage. And the broad value of heritability in branch number had reached the highest as 88.7%，followed by effective pedicel numbers and maximum pod length. Clustering analysis showed that the phenotype mutant strain accounted for 18.3%，among which the long-pod material was very common，while the multi-pod material was less.

Key words：EMS；Mutation；Cowpea；Phenotypic trait；Variation

Variation Analysis of Phenotypic Traits in Cowpea M2Population by EMS

ZHANG Zhong-wu，SUN Xin-cheng，ZHAN Yuan-hua，BAI Xiu-fang，TIAN Jun，YANG Lian-yong，KANG Jie
（Vegetable Institute，Changde Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Changde 415000，Hunan，China）

张忠武，男，高级农艺师，专业方向：蔬菜育种与栽培，E-mail：tczyzzw@163.com

2017-03-15；接受日期：2017-08-22

国家现代农业产业技术体系项目（CARS-25-G-32）