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右归丸对去势骨质疏松大鼠钙磷代谢和骨代谢的影响*

2017-10-19李健鹏颜春鲁安方玉刘永琦马正民牛彦强

中医研究 2017年10期
关键词:戊酸雌二醇甘肃

李健鹏,颜春鲁,安方玉,刘永琦,宋 敏,陈 丽,王 鹏,马正民,牛彦强

(1.甘肃中医药大学教学实验实训中心,甘肃 兰州 730030; 2.甘肃中医药大学基础医学院,甘肃 兰州 730030; 3.甘肃中医药大学中医临床学院,甘肃 兰州 730030;4.甘肃中医药大学公共卫生学院,甘肃 兰州 730030; 5.甘肃中医药大学临床学院, 甘肃 兰州 730030)

·实验研究·

右归丸对去势骨质疏松大鼠钙磷代谢和骨代谢的影响*

李健鹏1,颜春鲁1,安方玉1,刘永琦2,宋 敏3,陈 丽4,王 鹏3,马正民3,牛彦强5

(1.甘肃中医药大学教学实验实训中心,甘肃 兰州 730030; 2.甘肃中医药大学基础医学院,甘肃 兰州 730030; 3.甘肃中医药大学中医临床学院,甘肃 兰州 730030;4.甘肃中医药大学公共卫生学院,甘肃 兰州 730030; 5.甘肃中医药大学临床学院, 甘肃 兰州 730030)

目的:观察右归丸对去卵巢骨质疏松模型大鼠钙磷代谢和骨代谢的影响,探讨其干预机制。方法:将大鼠随机分为假手术组,模型对照组,右归丸低、中、高剂量组,戊酸雌二醇组6组,每组10只。除假手术组外,其余各组采用去卵巢法制备大鼠骨质疏松症模型,假手术组大鼠仅切除卵巢周围脂肪。造模成功后12周,戊酸雌二醇组给予雌激素戊酸雌二醇片(0.09μg/g)灌胃,假手术组和模型对照组给予等体积蒸馏水灌胃,右归丸干预组按高、中、低剂量依次给予右归丸5,10,20g/kg灌胃,1 d 1次,连续4周。末次给药结束,检测股骨组织中的骨密度(bone mineral density,BMD);股动脉采血检测血清的钙(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P )含量,骨钙素(osteocalcin,BGP)含量和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,trACP)含量;处死大鼠,取材计算胸腺、脾脏及肾脏指数,检测生物力学指标断裂载荷和定伸长-位移。结果:与模型对照组对比,假手术组大鼠股骨BMD水平、血清BGP、Ca和P含量升高,胸腺指数、脾脏指数和肾指数升高,股骨断裂载荷、定伸长-位移也升高,而血清trACP含量降低,差别均有统计学意义(P<0. 05)。与模型对照组对比,右归丸3个剂量组大鼠股骨BMD水平,血清Ca、P和BGP含量、股骨定伸长-位移升高,中、高剂量组胸、脾指数和断裂载荷升高,高剂量组肾指数亦升高,差别有统计学意义(P<0.05);而高剂量组大鼠血清trACP的含量则较模型对照组降低,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:右归丸通过提高去卵巢骨质疏松大鼠骨密度和改善骨代谢达到防治骨质疏松的目的。

右归丸/药效学;去势大鼠;BMD;Ca;P;BGP;trACP;脏器指数;断裂载荷;定伸长-位移;动物;大鼠

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于卵巢功能低下、雌激素缺乏导致骨吸收超过骨形成的一类全身性骨骼障碍性疾病,以骨量减少和骨组织微结构退化为特征,临床表现主要以各类疼痛、骨折为主[1-2]。目前治疗骨质疏松的药物主要有调节雌激素药物、骨形成促进药物、骨矿化促进药物等西药,长期服用会引发一系列毒副作用,如阴道出血、血栓形成、冠心病、子宫内膜癌及乳腺癌等,因此,寻找安全、低毒、有效的药物成为防治骨质疏松的重中之重。中医学认为,肾主骨生髓,通过补肾方药可以防治PMOP。右归丸为中医“温补肾阳,填精益髓”的代表方剂,本实验通过观察右归丸对去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨骨密度(bone mineral density,BMD),骨代谢标志物血清钙(Ca)、磷(P)、骨钙素(osteocalcin,BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,trACP),脏器指数,以及股骨生物力学指标断裂载荷、定伸长-位移的影响,以期为右归丸在治疗PMOP方面的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级SD雌性大鼠,60只,体质量(180±20)g,由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供,实验动物质量合格证编号:SCXK(甘)2011-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

右归丸由熟地黄24 g、山药12 g、山茱萸9 g、枸杞子9 g、鹿角胶12 g、菟丝子12 g、杜仲12g、当归9 g、肉桂6 g、制附子6 g等组成。换算成大鼠用量为:111g×0.018×5≈10 g/kg。常规水煎,制成质量分数为1 g生药/mL的药液。戊酸雌二醇片,拜耳医药保健有限公司广州分公司产品,批号156A;青霉素,华北制药股份有限公司产品,批号F6042103。水合氯醛,天津市光复精细化工研究所产品,批号20150105; Rat trACP ELISA Kit检测试剂盒(批号E20151102B)、Rat BGP ELISA Kit检测试剂盒(批号E20151201A),均为上海源叶生物科技有限公司产品;Ca试剂盒(批号20151127)、P试剂盒(批号20151204),均为南京建成生物工程研究所产品。iMark型自动酶标分析仪,美国Bio-Rad公司产品;FA2004N型电子天平,上海精密科学仪器有限公司产品;ZY12306型微量加样器,ScienTiFic产品;TDZ5-WS型医用离心机,湖南平凡科技有限公司产品;双能X骨密度仪,美国GE公司产品;AG-IX生物力学万能实验机,日本岛津公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将60只大鼠随机分为假手术组、模型对照组、戊酸雌二醇组、右归丸高剂量组、中剂量组、低剂量组6组,每组10只。按照文献[3-5]方法,以40 g/L水合氯醛(3μg/g)腹腔注射麻醉大鼠;俯卧位固定,备皮,消毒手术区皮肤;沿背部后正中线做1个1.0~1.5 cm的纵形切口;在乳白色发亮的脂肪团中找到棕黄色的卵巢,沿子宫角处结扎并切除卵巢;逐层缝合伤口。假手术组大鼠,仅切除卵巢周围脂肪。术后给予青霉素抗感染,大鼠术后注意保温。造模成功后12 w,给予药物干预:戊酸雌二醇组给予雌激素戊酸雌二醇片(0.09 μg/g)灌胃,假手术组和模型对照组给予等体积蒸馏水灌胃,右归丸干预组按高、中、低剂量依次给予右归丸5,10,20g/kg灌胃,1 d 1次,连续4周。

1.4 检测指标

1.4.1 骨密度

末次给药结束后,采用腹腔注射100 g/L 水合氯醛将各组大鼠麻醉,置于双能X 线吸收测量仪平台上,测定右股骨BMD。

1.4.2 血清 BGP、trACP、Ca和P含量

腹主动脉采血,静置2~3 h,1 500 r/min,离心10 min,分离血清。检测各组大鼠血清钙Ca、P、BGP、trACP,具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 胸腺指数、脾脏指数和肾脏指数

称量大鼠体质量,摘取胸腺、脾脏和肾脏并称量质量,计算各器官指数。胸腺(脾脏、肾脏)指数=胸腺(脾脏、肾脏)质量(mg)/体质量(g)。

1.4.4 断裂载荷和定伸长-位移

取出完整股骨,将其右侧股骨送至陆军总院,用AG-IX生物力学万能实验机检测断裂载荷和定伸长-位移等相应指标。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠BMD对比

与假手术组对比,模型对照组大鼠BMD降低,差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比,右归丸各剂量组和戊酸雌二醇组股骨BMD水平均升高,差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠BMD对比

组 别动物数BMD假手术组100.145±0.004*模型对照组100.116±0.007戊酸雌二醇组100.146±0.006*右归丸高剂量组100.146±0.004*右归丸中剂量组100.134±0.005*右归丸低剂量组100.124±0.004*

注:与模型对照组对比,*P<0.05

2.2 各组大鼠BGP、trACP、Ca和P含量对比

与假手术组对比,模型对照组大鼠血清BGP、Ca和P含量均降低,trACP含量升高,差别有统计学意义(P<0. 05)。与模型对照组对比,右归丸各剂量组和戊酸雌二醇组血清BGP、Ca和P含量均升高,右归丸高剂量组trACP含量降低,差别有统计学意义(P<0. 05)。见表 2。

组 别动物数BGP/(μg·L-1)trACP/(μg·L-1)Ca/(mmol·L-1)P/(mmol·L-1)假手术组102.00±0.20*0.46±0.14*2.07±0.07*0.30±0.02*模型对照组101.04±0.541.38±0.050.92±0.080.10±0.03戊酸雌二醇组101.65±0.17*0.99±0.181.89±0.11*0.22±0.03*右归丸高剂量组102.04±0.15*0.84±0.09*1.72±0.07*0.24±0.10*右归丸中剂量组101.55±0.17*0.91±0.081.63±0.12*0.19±0.05*右归丸低剂量组101.54±0.19*1.21±0.021.13±0.090.18±0.02*

注:与模型对照组对比,*P<0.05

2.3 各组大鼠胸腺指数、脾脏指数和肾脏指数对比

与假手术组对比,模型对照组大鼠胸腺指数、脾脏指数和肾脏指数均明显降低,差别有统计学意义(P<0. 05)。与模型对照组对比,右归丸中、高剂量组和戊酸雌二醇组大鼠胸腺指数、脾脏指数均显著升高,高剂量组肾指数升高,差别有统计学意义(P<0. 05)。见表3。

表3 各组大鼠胸腺指数、脾脏指数和肾脏指数对比

组 别动物数胸腺指数脾脏指数肾脏指数假手术组100.329±0.094*0.514±0.061*0.0062±0.0003*模型对照组100.122±0.0280.268±0.0220.0031±0.003戊酸雌二醇组100.297±0.096*0.457±0.110*0.0028±0.002右归丸高剂量组100.354±0.099*0.535±0.081*0.0052±0.0001*右归丸中剂量组100.288±0.069*0.480±0.055*0.0035±0.002右归丸低剂量组100.234±0.0470.409±0.0410.0031±0.001

注:与模型对照组对比,*P<0.05

2.4 各组大鼠断裂载荷、定伸长-位移参数对比

与假手术组对比,模型对照组大鼠股骨的结构力学参数断裂载荷、定伸长-位移等均下降,差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比,右归丸中、高剂量组和戊酸雌二醇组可明显改善去卵巢大鼠断裂载荷参数,右归丸各干预组和戊酸雌二醇组可明显改善去卵巢大鼠定伸长-位移参数,差别有统计学意义(P<0.05)。见表4。

组 别动物数断裂载荷/mPa定伸长-位移/KPa假手术组10142.17±0.15*1.45±0.021*模型对照组1086.22±0.090.17±0.012戊酸雌二醇组10122.17±0.14*0.54±0.014*右归丸高剂量组10115.36±2.84*0.43±0.021*右归丸中剂量组10110.61±0.52*0.33±0.020*右归丸低剂量组1095.57±3.210.26±0.025*

注:与模型对照组对比,*P<0.05

3 讨 论

将骨质疏松属中医学“骨痿”“骨痹”等范畴。中医认为,肾主骨,肾精充实则骨得其养,骨髓生化有源、坚固;肾精亏虚则骨失其养,骨髓化生乏源、骨骼脆弱;因此,肾虚精亏是骨质疏松的主要病机,治则以补肾为主[6]。右归丸方中以附子、肉桂、鹿角胶为君药,温补肾阳,填精补髓;以熟地黄、枸杞子、山茱萸和山药为臣药,发挥滋阴益肾、养肝补脾之功效;佐以菟丝子补阳益阴,固精缩尿;杜仲补益肝肾,强筋壮骨;当归养血活血,助鹿角胶以补养精血。诸药合用,共奏温补肾阳、填精止遗之效。

在骨代谢中,血液和尿液的生化指标是判定指标之一[7]。摘除卵巢后的大鼠肾脏尿钙排出增加,促进了血钙和骨钙的急剧减少,使骨形成和骨钙化能力进一步降低,导致骨骼中沉积的矿物质逐步减少,BMD和骨量降低,骨骼脆性增加,引发骨质疏松甚至骨折[7-8]。另外,机体摘除卵巢后,骨吸收大于骨形成,导致骨量增加受阻和骨生物力学发生改变。也有文献[9-11]证明,一些补肾壮骨中药能够抑制骨质疏松中骨密度的减少,明显改善骨生物力学参数的变化,升高骨质疏松大鼠BGP含量,降低trACP含量。本实验发现:右归丸能明显升高去卵巢模型大鼠血清中钙、磷含量,显著改善钙、磷代谢,促进骨组织钙化。同时,右归丸能够明显抑制去卵巢大鼠所致的骨密度丢失,升高卵巢大鼠的胸脾指数和BGP含量,降低trACP的含量,这些结果均与以往研究相一致,说明右归丸在骨质疏松防治方面具有一定效果。

综上所述,右归丸能明显提高去卵巢骨质疏松模型大鼠的骨密度和骨强度,可能是通过对钙、磷代谢,BGP和trACP代谢的调节而发挥预防和治疗骨质疏松的作用。

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1001-6910(2017)10-0064-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.10.27

颜春鲁,副教授,硕士,yanchl1979@126.com

甘肃省高等学校科研项目(2015A-097);甘肃中医药大学教学研究与教学改革项目(ZH-201606);甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重大实验室开放基金(FZYK15-16-7)

2017-07-05;

2017-08-25

(编辑 陶 珠)

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