正交试验法优选痛风颗粒水提工艺条件

施明毅，陈梓贤，李小芳，李建利,2*

正交试验法优选痛风颗粒水提工艺条件

施明毅1，陈梓贤1，李小芳1，李建利1,2*

目的：正交试验法优选痛风颗粒水提工艺条件。方法：采用高效液相色谱法测定绿原酸含量并进行方法学考察；以绿原酸含量及干浸膏收率为综合评价指标，选取影响水溶性成分提取率的蒸馏水的量、煎煮提取时间及煎煮次数作为考察因素，应用L9(34)正交试验设计选取最佳水提工艺条件。结果：最佳水提工艺条件为加8 倍量的水，煎煮3 次，每次1 h。结论：优选所得提取工艺条件稳定可行，可为痛风颗粒的工业生产提供试验依据。

痛风颗粒；提取工艺；正交设计；绿原酸

1 材料

Agilent1100高效液相色谱仪（仪器包括：Agilent色谱工作站、VMD紫外检查器，美国安捷伦公司）；DJ600-2型电子天平（成都倍塞克仪器表研究所）；FA1104N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；KQ5200型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZKW-4 型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

金银花、板蓝根、防己、骨碎补、皂角刺、鹿衔草、胆南星、天竺黄、没药、薏苡仁等药材（饮片），均购于四川省中药饮片有限责任公司，经该公司检验科检验合格。绿原酸（批号：110753-200413，供含量测定用）购于中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

痛风颗粒处方为临床上应用多年的祖传经验方，由金银花、板蓝根、骨碎补等多味中药组成，具有除湿解毒、化瘀散结的功效，用于热毒蕴结、痰湿凝滞所致的痛风性关节炎急性发作期。方中金银花、板蓝根等多味中药富含水溶性有效成分，其中绿原酸为金银花中重要的有效成分。本试验根据各药味的理化性质，通过水煎煮的试验方法，以金银花的有效成分绿原酸含量、干膏收率为考察指标

2 方法与结果

2.1 绿原酸含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 参照《中国药典》2015年版一部“金银花”项下绿原酸含量测定方法[1]进行试验。色谱柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250 mm），5 μm；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长：327 nm；理论塔板数按绿原酸峰计算不低于1000。

2.1.2 对照品溶液制备及线性 取绿原酸对照品约5.09 mg，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含40.7 μg的溶液，即得。精密吸取上述溶液2、4、6、8、10、20 μL，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，测定。以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=3121.8962X+5.8821，r=0.9998。结果绿原酸进样量在0.0814～0.8144 µg范围内具有良好线性关系，标准曲线见图1。

图1 绿原酸标准曲线图

2.1.3 供试品溶液制备及测定 按处方比例称取经60 ℃干燥的金银花、板蓝根等药材（饮片）适量，平行9份，按正交试验设计表进行提取，将药液滤过，合并后放冷，定容至250 mL，精密吸取药液各2 mL于蒸发皿中，40 ℃蒸干，残渣加50%甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定，结果见表2。

2.1.4 阴性对照溶液的制备及专属性 按处方比例称取经60 ℃干燥的除金银花以外的其他药材（饮片），照供试品溶液制备方法制备，即得。精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，测定。结果阴性对照溶液在327 nm处无干扰，见图2。

图2 绿原酸对照品溶液（A)、供试品溶液（B）、阴性对照溶液（C) HPLC图谱

2.2 干膏收率测定

精密吸取“2.1.3”项下定容后的供试品提取液各20 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称重，计算干膏收率。

2.3 正交试验设计及结果

查阅文献[2～6]，水煎煮工艺中，影响水煎煮提取效果主要因素有：加水量、煎煮时间、煎煮次数。本次试验在预试验的基础上，结合处方药物理化性质及临床疗程，以绿原酸含量及干浸膏收率（权重系数分别为0.8和0.2）为综合评价指标，按处方比例称取经60 ℃干燥的金银花、板蓝根等药材（饮片）适量，共9 份，进行L9(34)正交试验优化提取工艺。因素水平和试验安排结果见表1、2 ，方差分析结果见表3。

表1 痛风颗粒水煎煮工艺正交试验因素水平表

表2 痛风颗粒水煎煮工艺正交试验结果表

注：绿原酸含量评分=绿原酸含量/最大绿原酸含量×100×0.8；干膏收率评分=干膏收率/最大干膏收率×100×0.2；综合评分=绿原酸含量评分+干膏收率评分

表3 痛风颗粒水煎煮工艺正交试验方差分析表

结果表明，影响水提取综合得分的各因素作用的大小为A＞B＞C，A因素有显著性差异，B和C因素没有显著性差异，综合直观分析和方差分析结果，结合工业化生产需要考虑，确定最佳提取工艺为A3B2C2，即加8倍量水，煎煮3次，每次1小时。

2.4 验证试验

按处方比例称取经60 ℃干燥的金银花等药材（饮片），平行3份，按筛选的最佳提取工艺条件提取，结果绿原酸的平均含量为8.439 mg/g，RSD为1.06%，干膏平均收率为24.98%，RSD为0.97%，说明优选所得的提取工艺条件稳定性良好。见表4。

表4 痛风颗粒水煎煮工艺正交试验验证结果表

3 讨论

痛风颗粒处方来源于名老中医经验方，其经验方为汤剂和散剂用于临床，结合处方中药味的有效成分与现代药理研究，水提工艺开始设计为采用水煎煮提取金银花、板蓝根等药味，方中天竺黄、胆南星等两味中药材粉碎成细粉在制剂成型工艺中与干膏细粉和辅料进行混合，以便更好的发挥疗效。但通过预试验发现，二者混合粉碎时容易在粉碎过程中发热粘连成块，增大粉碎难度，影响粉碎效果。考虑到工业生产的可行性，故在后续工艺考察中，直接加入到水煎煮提取工艺中。

金银花为君药之一，与处方的解毒散结功能相关，而绿原酸又为其金银花的主要有效成分之一；防己作为方中佐药，与其祛湿功能相关，且防己诺林碱与粉防己碱常作为评价防己药材含量的指标，故以绿原酸、防己诺林碱和干膏收率作为指标性成分考察，但在含量测定的过程中，因复方中防己药材处方量相对较少以及提取过程的损耗，造成防己诺林碱的含量相对偏低，不宜进行含量测定，故最终确定绿原酸和干膏收率为综合指标进行工艺筛选。绿原酸含量测定流动相预试验，比较乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）、乙腈-0.4%磷酸溶液（12:88）和乙腈-0.4%磷酸溶液（20:80），试验结果乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）效果更好，故选择此流动相作为测定绿原酸含量。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 一部[S]. 北京：中国医药科技出版社，2015：221.

[2] 施明毅，李建利，谢燕，等. 正交试验法优选冠心康胶囊水提工艺条件[J]. 成都中医药大学学报，2013，36（1）：55-57,93.

[3] 陶德林.正交法优选复方骨碎补接骨片提取工艺的研究[J].中国现代应用药学,2010,27(5):409-411.

[4] 郑平原,胡咏华,蒋丽,等.正交试验优选复肝宁胶囊提取工艺[J].湖南中医药大学学报,2011,31(7):35-37.

[5] 刘钢,张平,夏泉.正交试验法优选金银花的提取工艺研究[J].海峡药学.2012,24(8):17-19

[6] 俞颖,郑东升,饶跃峰.复方鹿衔草颗粒制备工艺的研究[J].中国医药指南.2012,10(10):4-5.

(责任编辑：傅舒)

Optimization of extraction process with water of Tongfeng granule by orthogonal design/

SHI Ming-yi1, CHEN Zi-xian1,LI Xiao-fang1, LI Jian-li1,2//(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine , Chengdu 611137, Sichuan; 2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To optimize the extraction condition with water of Tongfeng granule by orthogonal design.Method:The measurement method of chlorogenic acid was detected by HPLC. The optimum extraction conditions were investigated by the L9(34) orthogonal design. The content of chlorogenic acid and dry extract yield were used as comprehensive evaluation indexes.The water amount, the extraction time and the extraction times were used as factors.Result:The optimal conditions were as follows: the raw materials were extracted three times with 8 times of water for 1 h.Conclusion:This optimized process is stable and feasible. It can provide test basis for industrial production of Tongfeng granule.

Tongfeng granule; extraction process; orthogonal design; chlorogenic acid进行综合评分，采用正交试验设计优选痛风颗粒最佳水提工艺条件，建立合理有效的提取方法，提高制剂的工艺水平。

R 283.6

A

1674-926X(2017)03-009-03

四川省教育厅重点项目（152A0094）；四川省科学技术厅科技成果支撑项目（08-2-242）

1成都中医药大学，成都市 611137；2四川省中医药科学院中医研究所，成都市 610031

施明毅（1984年12月-），男，医学硕士，助教，主要从事中药新制剂、新剂型与新技术，中药信息化研究。

Tel:15828507258 Email:thj125smy1222@163.com

李建利（1957年10月-），男，教授，硕士研究生导师，主任药师，主要从事中药新制剂、新剂型与新技术研究。

Tel:15902833306 Email:menguan1005@163.com

2016-12-5