分散固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中低聚果糖含量

2017-10-18潘城

分析科学学报 2017年6期

潘城

(国家加工食品质量监督检验中心，福建省产品质量检验研究院，福建福州 350002)

随着现代养殖规模化程度的不断提高和集约化养殖模式的推广，动物疫病防控的难度越来越大。低聚果糖作为抗生素替代物，在动物饲料中添加能显著提高饲料利用率，促进鸡、猪、鱼增重，增强其肠道有益菌增殖能力从而提高成活率，具有高效、安全、健康且绿色等特点[1]。本文作者曾发表过饲料添加剂中低聚果糖的检测[2]，但饲料添加剂基质相比饲料样品简单不少，对前处理要求不高。而饲料基质成分复杂，往往含有脂肪酸、有机酸、碳水化合物、甾醇、金属离子、色素等干扰物，同时饲料中添加低聚果糖含量都较低，前处理操作过于简单，不仅会污染色谱柱乃至过快报废，而且影响测定准确性。分散固相萃取法(Dispersive Solid-phase Extraction,DSPE)具有简便、快速和廉价的特点，近年来被广泛应用于食品中多农药残留和兽药残留检测[3 - 8]，但在饲料中应用较少[9 - 10]，而其应用于低聚果糖的检测还未见报道。本文采用DSPE净化，结合高效液相色谱(HPLC)，建立了饲料中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖四种低聚果糖的检测方法。该方法简便快捷，适用于饲料中低聚果糖的日常检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪(美国，Waters公司)，配2414示差折光检测器；DS-8510超声波发生器(上海生析超声仪器有限公司)；Milli Q超纯水制备器(美国，Milipor公司)；分析天平(赛多利斯北京有限公司)；Avanti J-E冷冻高速离心机(美国，贝克曼公司)。

低聚果糖标准品：蔗果三糖(纯度≥99.0%)、蔗果四糖(纯度≥99.0%)和蔗果五糖(纯度≥80.0%)，均购于日本和光纯药工业株式会社。蔗果六糖(纯度≥92.1%)购于北京振翔科技公司。标准储备液：准确称取低聚果糖标准品各200 mg，用50%乙腈溶解并定容至10 mL，配制成浓度为20 mg/mL的标准储备液。采用逐级稀释的方法配制浓度从0.1～5.0 mg/mL之间的系列标准工作溶液，所有标准储备液和标准工作溶液均置于冰箱中0～4 ℃下保存。乙腈为色谱纯(山东禹王实业有限公司)，其它试剂为分析纯。乙二胺基-N-丙基(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、佛洛里硅土填料购于安捷伦科技有限公司；Sepax GP-C18填料(40～60 μm,120 Å)购于美国赛分科技有限公司。

1.2 样品前处理

称取饲料样品10 g(精确至0.01 g)于100 mL的具塞三角瓶，加入70 mL 50%乙腈溶液，置于超声波振荡器中超声提取30 min后，转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度并混匀，4 000 r/min下离心5 min，取上清液2 mL，加入20 μL甲酸酸化后，加入100 mg的PSA和100 mg 的GCB作为复合吸附剂，涡旋混合1 min，15 000 r/min下离心5 min，取上清液以0.22 μm有机相滤膜过滤，滤液供分析用。

1.3 色谱条件

色谱柱：XB-NH2柱(250×4.6 mm，5 μm，美国Welch公司)；柱温：35 ℃；流动相：乙腈∶水=65∶35(V/V)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

图1 低聚果糖在不同色谱柱和不同比例流动相下分离效果比较Fig.1 Comparison of different columns and mobile phases for separation of fructooligosaccharides 1.fructose;2.glucose;3.sucrose;4.maltose;5.lactose;6.1-kestose;7.nystose;8.1F-fructofuranosylnystose;9.fructo-oligosaccharide;A.Sugar-Ca column with water as mobile phase;B.XB-NH2 column with acetonitrile-water=55∶45 as mobile phases;C.XB-NH2 column with acetonitrile-water=65∶35 as mobile phases.

实验比较了Xtimate Sugar-Ca型阳离子柱及XB-NH2柱这2种色谱柱对低聚果糖以及果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的分离效果(图1)。实验发现，4种低聚果糖以及其它糖类物质在钙型阳离子柱上无法有效分离(图1A)，而在氨基柱上能取得较好的分离效果(图1C)。本文同时考察了乙腈-水体系作为流动相的比例分别为55∶45、65∶35(V/V)进行等度洗脱时目标物的分离效果。结果表明，在乙腈∶水=55∶45(V/V)流动相体系下，分离效果欠佳(图1B)，蔗果三糖和乳糖等物质无法分离，而在乙腈∶水=65∶35(V/V)流动相体系下，4种低聚果糖以及果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖均达到基线分离(图1C)，同时由于氨基柱最佳使用条件为水相比例小于40%，长时间多频率使用40%和以上比例水相容易造成氨基柱键合相水解乃至报废，因而选择乙腈∶水=65∶35(V/V)体系作为流动相。

2.2 前处理条件优化

2.2.1提取体系的优化实验比较了纯水、50%的乙腈以及80%的乙腈超声萃取效果。经加标回收实验研究，超声30 min以上,纯水和50%的乙腈提取体系下低聚果糖的加标回收率均可达95%以上，而80%乙腈溶液提取的回收率低于65%。饲料基质复杂，往往含有蛋白质，添加一定比例的乙腈能够很好的沉淀饲料蛋白，同时由于50%的乙腈提取体系与流动相体系相近，能够较大程度的降低溶剂效应的影响，因而选择50%的乙腈作为提取溶剂。

2.2.2吸附剂的选择由于氨基色谱柱的pH使用范围为2～8，本文试验了PSA、C18、GCB、佛罗里硅土4种吸附剂在中性和酸性条件下的净化性能及对回收率的影响。结果表明：4种吸附剂在中性条件下均无良好吸附杂质或低聚果糖目标物的性能，而在酸性条件下4种吸附剂表现出不同程度吸附样品杂质的特性，同时不吸附低聚果糖目标物。相比较而言，饲料基质中的主要干扰物为脂肪酸、有机酸、碳水化合物、甾醇等极性干扰物以及金属离子，在酸性条件下PSA兼具极性吸附作用和弱阴离子交换作用，可以通过弱阴离子交换或极性吸附达到保留作用去除。同时饲料中经常含有色素干扰物，GCB具有良好的去除色素的性能。因此本文选择PSA和GCB作为复合吸附剂进行净化。

2.2.3样品酸度对净化效果的影响取2 mL饲料加标样品上清液，分别加入2、5、10、20、30、50 μL的甲酸调节酸度，再分别加入100 mg的PSA和GCB吸附剂涡旋混合5 min，离心后上机分离分析。结果表明，添加20 μL的甲酸能够得到较好的净化效果，更高的酸度不利于色谱柱的使用，因此实验选择样品中加入20 μL的甲酸。

图2 配合饲料空白基质加标样品净化前(A)后(B)效果对比图Fig.2 Comparison of the spiked swine feeds before (A) and after (B) purification 1.1-kestose;2.nystose;3.1F-fructofuranosylnystose;4.fructo-oligosaccharide.

2.2.4吸附剂用量对净化效果的影响考察了不同PSA和GCB用量(30、50、100、200、500 mg)条件下的净化效果。实验结果表明，所有用量条件下，两种吸附剂均不吸附低聚果糖目标物，100 mg吸附剂用量下，PSA净化效果不明显，100 mg吸附剂用量上，干扰得到较大程度的去除，同时所有PSA用量条件下，溶液颜色均较未净化溶液没有显著变化；当石墨化碳黑在100 mg用量以下时，净化液颜色相比未净化液变化不显著，说明色素等杂质无法完全去除，当GCB在100 mg用量以上时，净化液完全澄清透明。因此本文同时选择100 mg的PSA和100 mg的GCB作为复合吸附剂。图2为饲料空白基质加标样品净化前后效果对比图。

2.3 线性方程、线性关系、检出限及定量限

配制各浓度为0.1～5.0 mg/mL之间的系列标准溶液，以峰面积(y)对浓度(x)进行线性回归，其线性方程、相关系数、检出限见表1。结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖在0.1～5.0 mg/mL内具有很好的线性关系，相关系数R2不小于0.9997。以3倍信噪比(S/N=3)为检出限，如表1所示，各低聚果糖的检出限不高于0.069 mg/g，完全能满足测定要求。

表1 低聚果糖的回归方程、相关系数、线性范围及检出限Table 1 Regression equations， correlation coefficients(R2)， linear ranges and detection limits of fructooligosaccharides

2.4 回收率和精密度

在优化后测试条件下，取饲料空白基质样品进行加标回收测试，加标水平分别为5 mg/g、10 mg/g、20 mg/g，每个水平重复分析6次，结果见表2。从表2中可知，该方法的加标回收率为89.9%～102%，相对标准偏差(RSD)为1.4%～4.7%。结果表明该方法适用于饲料中低聚果糖的日常分析检测。