四种氨基酸神经递质对斑马鱼胚胎发育和成体组织再生的双重影响

李心雨，刘亚平，杜新路，严继舟

(上海海洋大学水产与生命学院生物系，上海 201306)

四种氨基酸神经递质对斑马鱼胚胎发育和成体组织再生的双重影响

李心雨，刘亚平，杜新路，严继舟

(上海海洋大学水产与生命学院生物系，上海 201306)

筛选小分子化合物促进组织再生仍然是再生医学的一个巨大挑战。前期研究提示神经递质在斑马鱼(Daniorerio)下颌再生过程中发挥着重要作用。本实验分别剪切Flk-GFP转基因斑马鱼成体下颌组织和1月龄幼鱼尾鳍，然后将其置入四种神经递质(牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸以及γ-氨基丁酸)的浓度梯度环境中，培养5 d后取成鱼下颌制作冰冻切片进行观察检测新生血管荧光量，对幼鱼尾鳍再生进行长度测量。结果显示甘氨酸和γ-氨基丁酸对损伤组织的再生表现出促进作用，而牛磺酸和谷氨酸表现出在低浓度时促进与高浓度的抑制作用。胚胎培养和早期胚胎细胞增生的MTT试验进一步验证了氨基酸神经递质在不同浓度所表现出的细胞营养和毒性作用。结果提示有必要建立一个多层面包括从细胞-胚胎-幼鱼和成鱼的斑马鱼检测系统,能有效筛选再生相关小分子化合物及其合适浓度。

神经递质；牛磺酸；谷氨酸；甘氨酸；γ-氨基丁酸；斑马鱼(Daniorerio)；组织再生

Abstract：Screening small molecules targeting tissue regeneration remains challenge in regenerative medicine.The previous investigations have indicated that neurotransmitters play important roles in the process of regeneration inDanioreriojaw.Flk-GFP transgenicD.rerioadult jaw and 1-month-old caudal fins were separately cut in this study,and then rear the damaged fishes for 5 days in the presence of four amino acid neurotransmitters (taurine,glutamate,glycine,and γ- aminobutyric acid (GABA)) at gradient concentrations.Their effects on tissue regeneration were compared by measuring GFP intensity of cryosections,or by measuring the caudal fin regeneration length.The results showed that glycine and GABA promote damaged tissue regeneration,while taurine and glutamate exhibit promotion at low concentrations and inhibition at high concentrations.D.rerioembryo culture and MTT assays on embryonic cell proliferation further demonstrate the dosage dependent- cell nutrition and cytotoxicity of the four amino acid neurotransmitters.This experiment suggests that it is necessary to set up a multifacetedD.reriosystem covering cell,embryo,larvae and adult，which can effectively screen the regeneration-related small molecule compounds and their suitable concentrations.

Keywords：neurotransmitter；taurine；glutamate；glycine；GABA；Daniorerio；tissue regeneration

组织再生一直是许多生物研究者所研究的重要课题。再生能力在不同物种间差异很大,与人及高等脊椎动物相比,低等脊椎动物(如斑马鱼)有着较强的再生能力[1]。低等生物的组织和器官部分或全部损伤后可以完全再生，弄清它们再生的过程与调控机制，是现代再生医学所关注的重要内容之一，将为哺乳类和人类的组织再生提供理论依据。斑马鱼(Daniorerio)作为一种极好的模式生物，具有和人类87%的同源基因，它的鳍、视神经、脊髓、心脏等都具有很强的再生能力[2],是很好的脊椎动物组织再生的初步模型系统[3]。

小分子神经递质不仅能够作为突触间的信息连接，也参与到发育和组织再生的调控中。快速筛选具有促进组织再生的小分子化合物对于再生医学具有重大研究意义。神经递质多巴胺(dopamine,DA)和γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)在下颌再生和视网膜再生的斑马鱼的脑部和再生局部器官都出现动态变化[4]。目前尚未有系统比较牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸以及γ-氨基丁酸在胚胎发育和成体组织再生方面的报道。本实验的目的是研究牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸以及γ-氨基丁酸这四种神经递质在斑马鱼下颌以及尾鳍组织再生中的作用，以期构建一个活体斑马鱼系统模型，用于快速筛选组织再生相关的小分子物质。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 实验用鱼

实验用鱼为本实验室繁殖传代的AB野生型和Flk1-GFP转基因斑马鱼，作为血管再生的标志[5]。

1.1.2 实验试剂

牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、多聚甲醛、MTT试剂盒(以上试剂均购自上海生工生物有限公司)、DAPI封片剂(Sigma)

1.2 实验方法：

1.2.1 组织取材

为了比较氨基酸神经递质对组织再生的影响，实验选取斑马鱼成鱼为研究对象，每组3～5尾，分缸培养。实验前用0.05%的MS-222对斑马鱼进行短暂麻醉处理，再用手术剪刀剪除下颌前端约1/3部分，剪切后将鱼分别置于牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸的浓度梯度环境中，于5 d后再次剪切，制作冰冻切片。

为了说明高浓度氨基酸神经递质对组织再生有抑制作用，我们比较高浓度氨基酸(1 mmol/L和4 mmol/L)对尾鳍再生的效果。实验选取约1月龄斑马鱼为研究对象，每组3～5尾，分缸培养。实验前用0.05%的MS-222对斑马鱼进行短暂麻醉处理，再用手术剪刀从其尾鳍开叉处剪切，剪切后将鱼置于牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸的浓度环境中，分别于第2天和第5天在体视荧光显微镜 (Zeiss Stereo Disccovery v12)下观察拍照。

1.2.2 冰冻切片的制备

方法详见参考文献[6]

1.2.3 细胞增殖及细胞活力测定

根据浓度梯度预实验结果，将刚孵出的胚胎置于四种氨基酸的三种浓度环境(0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，1 mmol/L)中，设置空白对照，在恒温箱中静置4 h。手工去膜后，再置于MTT试剂中培养4 h，使用酶标仪(microplate reader)在570 nm下测定吸光度值(OD value)。

1.2.4 数据分析和处理

1.2.4.1 图像数字化处理

借助Adobe Photoshop CC (64 Bit) 测定四种药物各浓度梯度影响后第5天下颌相同大小区域Flk1-GFP荧光相对强度平均值和标准差，然后根据荧光强度平均值(M)和差异系数(CV)计算再生相对强度(RI)。RI=M/CV。这里M表示血管再生强度，CV表示再生分布的差异。另外也测量尾鳍再生的长度，即新生组织距分叉处最大值。图像数字化后，借助Graphpad Prism 6进行数据分析，做出统计图。

1.2.4.2 OD值的统计学分析

各组测得的实验组吸光度值与空白对照组比较,所得差值表示活细胞数量的增减。利用SPSS Statistics 19 win32统计软件，通过单因素方差分析进行差异的显著性检验；运用Duncan多重比较检验差异，取P<0.05为差异显著。比较方法常用标字母法，凡有相同字母的平均数即表示差异不显著，凡无相同字母的平均数即表示差异显著。

2 结果

2.1 四种氨基酸神经递质对成鱼下颌组织再生的影响

根据GFP绿色荧光相对强度和相对再生强度的测定结果(图1)，与未剪切组相比，牛磺酸(Taurine)只在0.1 mmol/L浓度时有着较好的促进效果，血管增生相对增多。而在0.05 mmol/L及1 mmol/L浓度时，血管荧光信号强弱不等，分布不均匀，离散程度大。

图1 牛磺酸对血管再生的影响及其相对再生强度分析Fig.1 The effect of taurine on blood vessel regeneration and analysis of dosage-dependent relative regenerative intensity.(A)未剪切下颌(CK)；(B)-(D)剪切1/3的下颌分别置于牛磺酸浓度为0.05、0.1和1 mmol/L。

由图2可见，谷氨酸在0.05 mmol/L浓度时表现出明显促进再生作用，在0.1 mmol/L以及1 mmol/L浓度时则表现出抑制的作用，整体趋势为低浓度促进，高浓度抑制。与未剪切组相比，在高浓度(1 mmol/L)时荧光分布更不均匀，离散程度大。

图2 谷氨酸对血管再生的影响及其相对再生强度分析Fig.2 The effect of Glu on blood vessel regeneration and analysis of dosage-dependent relative regenerative intensity.(A)未剪切下颌(CK)；(B)-(D)剪切1/3的下颌分别置于谷氨酸(Glu)浓度为0.05、0.1和1 mmol/L

甘氨酸表现出对血管再生有一定的促进作用，特别是0.05 mmol/L时，荧光信号强，且分布密集。但在1 mmol/L时能抑制血管的增生(图3)。与未剪切组相比，三种不同甘氨酸浓度下都呈现荧光均匀分布状态。

γ-氨基丁酸对于下颌再生与谷氨酸表现出相似的作用，即在0.05 mmol/L和0.1 mmol/L浓度下表现出较好的促进作用，而在1 mmol/L时呈现抑制增生的结果(图4)。同时，与未剪切组相比，在1 mmol/L时荧光分布更不均匀，离散程度大。

总之，四种氨基酸神经递质都具有促进组织再生的功能，但促进组织再生的合适浓度不尽相同。牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸浓度分别为0.1，0.05,0.05和0.1 mmol/L。当氨基酸浓度增加到1 mmol/L浓度时，四种氨基酸都表现为抑制作用。

图3 甘氨酸对血管再生的影响及其相对再生强度分析Fig.3 The effect of Gly on blood vessel regeneration and analysis of dosage-dependent relative regenerative intensity.(A)未剪切下颌(CK)；(B)-(D)剪切1/3的下颌分别置于甘氨酸(Gly)浓度为0.05、0.1和1 mmol/L

图4 γ-氨基丁酸对血管再生的影响及其相对再生强度分析Fig.4 The effect of GABA on blood vessel regeneration and analysis of dosage-dependent relative regenerative intensity.(A)未剪切下颌(CK)；(B)-(D)剪切1/3的下颌分别置于γ-氨基丁酸(GABA)浓度为0.05、0.1和1 mmol/L。

2.2 四种氨基酸神经递质对幼鱼尾鳍组织再生的影响

与剪切不加氨基酸对照组相比，四种神经递质在4 mmol/L浓度时，均表现出对尾鳍再生有不同程度的抑制作用，从强到弱依次为谷氨酸、γ-氨基丁酸、牛磺酸和甘氨酸。只有甘氨酸在2 dpa时表现出促进再生作用。图5为4 mmol/L氨基酸处理各组尾鳍剪切2 d(2 dpa)和5 d(5 dpa)后再生长度的测量结果。与未剪切组相比，可以看到剪切的尾鳍组织在5 d时已长出原有尾鳍的一半以上，其中，牛磺酸和甘氨酸具有较好的再生效率，恢复率分别为60%～70%。

2.3 四种氨基酸神经递质对胚胎发育的影响

结果显示4 mmol/L的四种氨基酸神经递质对胚胎存活均有不同影响。添加氨基酸20 h后，各试验组胚胎存活率均逐渐下降；48 h后牛磺酸组和GABA组胚胎全部死亡，60 h谷氨酸组胚胎死亡，只有甘氨酸组还有存活的胚胎 (图6)。

MTT实验结果显示0.05 mmol/L下，牛磺酸组细胞存活明显高于谷氨酸和甘氨酸组，但其他氨基酸组之间无显著差异；0.1 mmol/L下，牛磺酸组明显低于其它组，谷氨酸组明显高于甘氨酸组。在1 mmol/L下，除甘氨酸与GABA之间无显著差异外，牛磺酸明显低于谷氨酸，后者又明显低于甘氨酸和GABA(图7)。实验表明：不同药物不同浓度，对细胞增殖状况有不同影响。其中，细胞对牛磺酸浓度增加最敏感，而对GABA浓度变化不敏感，与体内试验结果相符。

图5 四种氨基酸神经递质对幼鱼尾鳍再生的影响.Fig.5 Effects of four amino acid neurotransmitters on the regeneration of larval cadual fins(注：Taurine：牛磺酸；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；GABA：γ-氨基丁酸)

图6 四种氨基酸对胚胎发育的影响Fig.6 Effects of four amino acids on the embryonic development

图7 早期胚胎分别置于四种小分子不同浓度的相对吸光度Fig.7 The OD value of early embryos relative to control凡有相同字母的即为差异不显著，凡无相同字母的即为差异显著

3 讨论

机体损伤后不仅激发局部组织器官修复，而且激发全身资源的重新分配，其中神经组织通过神经递质发挥重要调节作用[4]。神经递质不仅介导神经元之间和神经元与效应器之间的信息传递，而且作为细胞外环境中的一员也参与了神经干细胞(NSC)的增殖和分化。但目前神经递质受体在NSC增殖和分化中的表型变化尚不完全清楚，神经递质以及神经递质受体在NSC增殖和分化中信号转导的研究也不多见。谷氨酸作为一种兴奋性神经递质，可以作为神经营养剂或者神经毒性剂[7]。一些资料表明，在脑的发育过程中有高含量的谷氨酸表达。谷氨酸对神经细胞分化也有作用，它可促进神经元生长和分化，NMDAR(谷氨酸离子型受体)激活可促进小脑颗粒神经元神经突起的过度生长以及海马细胞的分芽[8]，并可促进神经突触的形成。在斑马鱼下颌修复过程中，下颌、脑部和肝脏部位从修复 2 h开始谷氨酸和甘氨酸含量便呈现上升的趋势，到2 d时达到高峰，随后便缓慢下降[9]。对产后大鼠施加代谢型谷氨酸受体激动剂，会产生视神经萎缩，并引发视网膜毒性[10]。此外，谷氨酸大剂量时会导致大鼠海马细胞死亡[11,12]，小鼠脑皮层细胞死亡[13]，以及大鼠视网膜神经节细胞死亡[14]。本实验证实谷氨酸在低浓度时表现出促进再生，在高浓度时则抑制再生和胚胎发育，甚至导致胚胎细胞死亡。

甘氨酸在中枢神经系统，尤其是在脊椎、脑干和一些脑区，甘氨酸受体(GlyR)通过增加突触后细胞膜Cl-通透性而起突触后抑制作用，是一个抑制性神经递质。但在本实验中，甘氨酸表现出促进再生效果。另一个抑制性神经递质GABA，也对组织再生表现出促进作用。已有研究表明[15],GABA可促进胚胎大鼠脊髓和皮质神经细胞的迁移，并可部分促进大鼠海马锥体神经元、小鼠颗粒神经元和胚胎鸡顶盖神经元神经突起的生长。本实验中，甘氨酸与GABA的最适浓度不一样，分别在0.05 mmol/L和0.1 mmol/L具有较突出的组织再生促进作用。另外，胚胎细胞对二者浓度变化有较好的耐受性，特别是GABA。

牛磺酸是中枢神经系统最丰富的游离氨基酸之一，其各种生物学功能可以作为调制生物体的激动剂[16]。众多研究表明，牛磺酸可使受损的神经，如大鼠海马齿状回区神经元再生、视网膜光化学损伤以及其它组织的修复、再生，以及在生长发育中都有着重要的作用。牛磺酸可以提高金鱼视网膜外植体突起的长度和密度[17]，这个过程是通过增加钙通量的营养作用来进行的[18]。与先前的研究不同，本实验发现牛磺酸有严格的浓度限制。只是在0.1 mmol/L浓度时表现出最佳的促进下颌组织的再生作用，浓度增高相反会表现出细胞毒性。

本实验结果充分体现了不同浓度的氨基酸神经递质在组织再生的促进和抑制双重作用。第一，兴奋性神经递质和抑制性神经递质在组织再生过程中都是必要的，扮演精细调节角色。在斑马鱼下颌修复早期，兴奋性递质如 多巴胺 和谷氨酸含量增加的速度明显高于抑制性递质 GABA 和 甘氨酸，即兴奋性递质的释放很可能是在传递着下颌细胞增殖和组织修复的信号[9]。显然兴奋性氨基酸过度刺激会损害组织的再生。第二，这些神经递质不仅以递质的形式存在，同时还是物质和能量代谢的重要成份，参与细胞新陈代谢，表现出营养和毒性。在低浓度时较多体现在物质代谢中的作用，在高浓度时作为神经递质的调节作用得到凸显。相比之下，GABA在三种浓度下均具有促进增殖作用，而高浓度(1 mmol/L)谷氨酸具有明显毒性效应。这一点在组织再生和胚胎发育的作用是一样的。实时检测氨基酸神经递质的含量和平衡能动态，有助了解再生组织细胞间的神经调节和再生细胞的新陈代谢状况。组织再生依赖再生细胞彼此之间的协作，其代谢系统整体之间的氨基酸水平的精细调节十分重要。

总之，本实验从斑马鱼胚胎、幼鱼尾鳍和成体器官以及胚胎细胞水平揭示了氨基酸神经递质在胚胎发育、成体组织再生和胚胎细胞增生具有不相一致的调节作用，比如，0.1 mmol/L牛磺酸最适合下颌组织再生；而在细胞水平，0.05 mmol/L牛磺酸最利于胚胎细胞增生。同样，0.05 mmol/L谷氨酸最适于下颌组织再生；而0.1 mmol/L浓度胚胎细胞生长最好。如果选用氨基酸神经递质混合物，最佳合适浓度将定为0.05 ～0.1 mmol/L浓度。因此利用一个完整检测系统，可有效筛选发育和组织再生相关的小分子药物及其浓度。

致谢：上海海洋大学海洋生物系和神经科学研究所老师和同学对本课题研究给予了许多帮助，在此表示感谢。

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DualeffectsoffouraminoacidneurotransmittersonDaniorerioembryonicdevelopmentandadulttissueregeneration

LI Xin-yu,LIU Ya-ping,DU Xin-lu,YAN Ji-zhou

(DepartmentofBiology,CollegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

2017-03-12；

2017-07-12

上海市教委大学生科研创新项目(B-5106-13-0001)；上海市教委水产高峰学科项目(A1-2035-17-0001B3-12)

李心雨(1997- )，专业方向为水生生物学。E-mail:975683903@qq.com

严继舟。Email:jyan2@shou.edu.cn

S942.1

A

1000-6907-(2017)05-0058-06