雅鲁藏布江中游6种裂腹鱼乳酸脱氢酶同工酶的比较研究

魏玉众，张桂蓉，霍 斌，谢从新，陈生熬,

(1.塔里木大学动物科学学院 新疆阿拉尔 843300；2.华中农业大学水产学院 武汉 430070)

雅鲁藏布江中游6种裂腹鱼乳酸脱氢酶同工酶的比较研究

魏玉众1，张桂蓉2，霍 斌2，谢从新2，陈生熬1,2

(1.塔里木大学动物科学学院 新疆阿拉尔 843300；2.华中农业大学水产学院 武汉 430070)

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对雅鲁藏布江中游6种裂腹鱼(尖裸鲤Oxygymnocyprisstewartii、拉萨裸裂尻鱼Schizopygopsisyounghusbandi、巨须裂腹鱼Schizothoraxmacropogon、拉萨裂腹鱼S.waltoni、双须叶须鱼Ptychobarbusdipogon和异齿裂腹鱼S.o’connori)的心肌、肌肉、肝脏、肾脏和晶状体5种组织的LDH(乳酸脱氢酶)同工酶进行比较分析。结果表明LDH同工酶的表达具有明显的组织和种间差异性。尖裸鲤、拉萨裸裂尻鱼和双须叶须鱼由LDH-A、LDH-B和LDH-B1基因编码，5种组织中分别检测到16、13和9条酶带；拉萨裂腹鱼和巨须裂腹鱼由LDH-A、LDH-B和LDH-C基因编码，5种组织中分别检测到9和6条酶带；异齿裂腹鱼由LDH-A和LDH-B基因编码，5种组织中检测到6条酶带。根据酶谱特征对其生物演化进行了探讨，发现尖裸鲤和拉萨裸裂尻鱼特化程度最高，其次是双须叶须鱼，巨须裂腹鱼、拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼特化程度最低，与形态学特征所划分的三个类群吻合。

裂腹鱼；LDH同工酶；聚丙烯酰胺凝胶电泳；组织差异性；种间差异性

Abstract：In order to compare the expression of lactate dehydrogenase (LDH) isozymes amongOxygymnocyprisstewartii,Schizopygopsisyounghusbandi,Schizothoraxmacropogon,S.waltoni,PtychobarbusdipogonandS.o’connori,five tissues (cardiac muscle,muscle,liver,kidney and lens) were analyzed by using discontinuous polyacrylamide gel electrophoresis technology.The results indicated that LDH isozyme expression of the six schizothoracinae fishes has tissue and species specificity.16,13 and 9 LDH isozyme bands encoded by LDH-A,LDH-B and LDH-B1loci were detected in all the 5 tissues ofO.stewartii,S.younghusbandiandP.dipogon,respectively.9 and 6 LDH isozyme bands encoded by LDH-A,LDH-B and LDH-C loci were observed in all the 5 tissues ofS.waltoniandS.macropogon,respectively.6 LDH isozymebandsencodedbyLDH-AandLDH-Blociweredetectedinallthe5tissuesofS.o’connori.According to the characteristics of enzyme spectrum,O.stewartiiandS.younghusbandiwere characterized by the highest specialization degree,thenP.dipogon,and finallyS.macropogon,S.waltoniandS.o’connori.The LDH isozymes evolutionary characteristics of the six Schizothoracinae fishes were corresponded with morphological division of the three groups.

Keywords：Schizothoracinae；LDH isozyme；polyacrylamide gel electrophoresis；tissue specificity；species specificity

分布于西藏雅鲁藏布江中游干支流及附属水体的尖裸鲤(Oxygymnocyprisstewartii)、拉萨裸裂尻鱼(Schizopygopsisyounghusbandi)、巨须裂腹鱼(Schizothoraxmacropogon)、拉萨裂腹鱼(S.waltoni)、双须叶须鱼(Ptychobarbusdipogon)和异齿裂腹鱼(S.o’connori)同属鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)，为我国特有种，也是青藏高原地区的重要经济鱼类[1]。近年来由于人类活动和自然环境因素的影响，数量急剧下降，合理开发和利用该种渔业资源刻不容缓。

同工酶，作为一种生化指标，已广泛应用于鱼类的种群遗传结构和物种亲缘关系的分析、物种及杂种鉴定[2-8]，是鱼类种质标准的遗传学参数之一。本研究利用电泳技术对6种裂腹鱼LDH(乳酸脱氢酶)同工酶进行比较研究，以期为它们的种质鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品处理

实验用鱼均于2015年11月采自西藏雅鲁藏布江曲水段，采集6种裂腹鱼，共计146尾，活体运到实验室，未分雌雄，活体解剖，取实验用的心肌、肌肉、肝脏、肾脏和晶状体5种组织。将各组织编号放入离心管内，于-70 ℃冰箱中保存备用。

实验用鱼大小分布范围，尖裸鲤30尾，体长180.2～432.5 mm，体重76.2～1 050.6 g；巨须裂腹鱼30尾，体长205.3～346.7 mm，体重146.2～690.4 g；双须叶须鱼30尾，体长247.3～369.2 mm，体重197.4～590.2 g；异齿裂腹鱼30尾，体长280.3～355.5 mm，体重300.4 ～640.6 g；拉萨裂腹鱼12尾，体长232.5～316.1 mm，体重154.6～340.2 g；拉萨裸裂尻鱼14尾，体长153.3～205.5 mm，体重57.3～160.2 g。

取各组织0.5 g于研钵内，并按1∶2(W∶V)的比例加20%的蔗糖在冰浴条件下进行匀浆并分装于离心管内。将各组织的匀浆液于4 ℃，12 000 r/min条件下离心40 min，后取其上清液按1∶1(V∶V)的比例加入氯仿，再次离心30 min，取其上清液，并分装于离心管内(每个离心管取样量50 μL)，于-20 ℃中短时间保存。临用前加入7 μL的溴酚蓝作指示剂进行电泳。

1.2 电泳

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳法对各组织进行电泳。电泳参数和电泳缓冲系统为：分离胶浓度为7.5%，pH 8.9；浓缩胶浓度为3%，pH 6.7；电极液为pH 8.3，浓度1%的Tris-Gly缓冲液，使用前稀释10倍。加样量为10 μL，采用10 mA电流预泳，待其指示剂过浓缩胶，电流调为20 mA，电泳时间为6 h。电泳的整个过程在10 ℃条件下进行。

1.3 染色方法

电泳结束后，取出凝胶，放在染色液中在37 ℃条件下进行染色，显带清晰后立刻用蒸馏水冲洗，然后拍照(Nikon4500)保存。染色液的配制为：1% NAD 3 mL、6%乳酸钠2 mL、1% NBT 4.8 mL和1% PMS 0.4 mL。

1.4 分析方法

LDH同工酶以区带数目、染色强度和相对迁移特性为指标进行分析比较。

2 结果与分析

2.1 异齿裂腹鱼各组织LDH同工酶的表达

异齿裂腹鱼的肌肉组织表达A4、A3B、A2B2和显带极弱的A14共4条酶带；晶状体、肝脏、心肌和肾脏组织均表达A4、A3B、A2B2、AB3和B4共5条酶带(图1)。

图1 异齿裂腹鱼各组织的LDH酶谱Fig.1 LDH enzyme spectrum of S.o’connoriE:晶状体,L:肝脏,H:心肌,K:肾脏,M:肌肉,下图同

2.2 双须叶须鱼各组织LDH同工酶的表达

双须叶须鱼LDH同工酶酶谱，除A4和A3B主带间没有副带表达，各组织在每2条主带间均有显色深度弱于主带的副带表达。肌肉组织表达A4、A3B和A14共3条酶带；晶状体组织表达A4、A3B、A2B2、AB3、B2B12、BB13共6条酶带；肝脏、心肌和肾脏组织表达A4、A3B、B2B12、A2B2、BB13、AB3、B14和B4共8条酶带(图2)。

图2 双须叶须鱼各组织的LDH酶谱Fig.2 LDH enzyme spectrum of P.dipogon

2.3 拉萨裸裂尻鱼各组织LDH同工酶的表达

拉萨裸裂尻鱼各组织酶带较纤细。肌肉组织表达A4、A3B、A2B2和A14共4条酶带；晶状体、肝脏、心肌和肾脏组织均表达A4、A3B、A2B2、A3B1、AB3、B4、B12A2、B1B3、B12B2、B13A、B13B和B14共12条酶带(图3-a)，其中，晶状体组织不同个体间表达的酶带数有差异(图3-b)。

图3 拉萨裸裂尻鱼各组织的LDH酶谱Fig.3 LDH enzyme spectrum of S.younghusbandi

2.4 拉萨裂腹鱼各组织LDH同工酶的表达

拉萨裂腹鱼肌肉组织表达A4及A3A1、A2A12、AA13和A14共5条酶带；心肌和肾脏组织表达A4、A3B、A2B2、AB3、A3A1、A2A12、AA13和A14B4共9条酶带；晶状体组织表达A4、A3B、A2B2、AB3和B4共5条酶带；肝脏组织表达A4、A3B、A2B2、AB3和B4酶带以及C基因表达的3条酶带，靠近负极，共8条酶带(图4-a)，且不同个体间表达的酶带数有差异(图4-b)。

图4 拉萨裂腹鱼各组织的LDH酶谱Fig.4 LDH enzyme spectrum of S.waltoni

2.5 巨须裂腹鱼各组织LDH同工酶的表达

巨须裂腹鱼肌肉组织表达A4和A14 共2条酶带；晶状体组织表达A3B、A2B2、AB3和B4共4条酶带，没有A4酶带；肝脏组织表达很弱的A4和A3B酶带以及C基因表达的3条酶带共5条酶带；心肌和肾脏组织均表达A4、A3B、A2B2、AB3和B4共5条酶带(图5)。

2.6 尖裸鲤各组织LDH同工酶的表达

尖裸鲤各组织表达的酶带纤细。肌肉组织表达A4、A3B、A2B2、AB3、B4、和A14共6条酶带；晶状体、肝脏、心肌和肾脏组织表达A4、A3B、A2B2、A3B1、AB3、B4、B12A2、B1B3、B12B2、B13A、B13B和B14共12条酶带(图6-a)，其中，心肌组织除上述酶带外，还表达了A14、AA13、A2A12和A3A1酶带，共16条酶带(图6-b)。

图6 尖裸鲤各组织的LDH酶谱Fig.6 LDH enzyme spectrum of O.stewartii

3 讨论

3.1 裂腹鱼LDH同工酶组织差异性分析

LDH是研究最为广泛和深入的同工酶，在鱼类中多有LDH-A、LDH-B和LDH-C基因编码，LDH-A和LDH-B基因可随机形成5种同工酶，分别是A4、A3B、A2B2、AB3和B4，LDH-B基因编码的蛋白迁移率速率大于LDH-A基因编码的蛋白[9]。LDH-C基因在鱼类中多具有组织特异性，一般不与LDH-A和LDH-B基因杂合，鲤形目鱼类中多为肝脏组织所特有，电泳时多趋向于阴极[10]。本研究中，LDH-A和LDH-B基因在各组织中均有表达，LDH-C基因仅在巨须裂腹鱼和拉萨裂腹鱼肝脏组织中特异表达，可能与其肝脏代谢旺盛密切相关[9]；其他4种裂腹鱼中未见LDH-C基因的表达，可能是这几种裂腹鱼没有LDH-C基因的存在或该基因处于失活状态[11]。

表1 LDH同工酶在6种裂腹鱼5种组织中的分布和活性比较Tab.1 Distribution and activity of LDH isozyme in 5 tisues of 6 species of Schizothoracinae

续表

注：“*”表示活性,越多表示活性越强;“-”表示无

表2 LDH同工酶在各组织中表达的带数Tab.2 Number of LDH isozyme band expressed invarious organizations

LDH同工酶是催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶，在有氧氧化和无氧酵解之间起着重要作用，几乎存在于所有组织的一种糖酵解酶，LDH-A基因表达的酶类多在厌氧组织骨骼肌中优势表达，其功能是将丙酮酸还原为乳酸；LDH-B基因表达的同工酶多在含氧组织中优势表达，其功能是将乳酸氧化为丙酮酸[11]。6种裂腹鱼肌肉组织中A4酶带占明显优势，这可能是催化丙酮酸转化为乳酸，参与无氧代谢，为其适应高原冷水环境肌肉的快速反应提供能量保证；B4酶带在心肌、肝脏和肾脏组织中占明显优势，LDH-B基因编码的酶类活性也是最高的，这是代谢功能旺盛的好氧性组织有氧代谢的必要条件[12]。

经多次重复实验发现，尖裸鲤和双须叶须鱼晶状体组织LDH同工酶酶带较多且电泳图谱不稳定，可能是组织制备及保存等问题造成的；拉萨裸裂尻鱼晶状体组织和拉萨裂腹鱼肝脏组织，不同个体间表达的酶带数有明显的差异，可能是酶的编码基因因活性表现程度不同或基因表达后由于酶受到不同因子的调控造成的；巨须裂腹鱼晶状体组织中没有A4酶带的表达，可能是由于酶的编码基因不是同时表达，而造成酶带数量不同造成的[13]。6种裂腹鱼肌肉组织、尖裸鲤的心肌与拉萨裂腹鱼的心肌和肾脏组织LDH-A基因位点所编码的酶带数个体间均有差异，且靠近阴极，说明LDH-A基因位点在不同个体中有变异，存在多态性[14]。

裂腹鱼类LDH同工酶的组织差异性，是机体在特定环境下适应高原气候寒冷多变的生态环境及组织分化并特异性执行各自功能的结果。

3.2 裂腹鱼LDH同工酶种间差异性分析

同工酶本质上是基因的产物，同工酶谱的不同反映着基因型的不同，同工酶结构的变化是由同工酶基因变异所导致的[6]。本研究显示，不同裂腹鱼的同工酶谱有所不同，这种差异称之为同工酶的种属差异性。一般认为酶谱越相似，说明亚基中氨基酸组成也相似，进而可推测其亲缘关系相近程度[15]。通过对6种裂腹鱼5种组织的LDH酶谱比较(表1)发现，本研究中的6种裂腹鱼可分为2个类群，尖裸鲤、拉萨裸裂尻鱼和双须叶须鱼为一类；拉萨裂腹鱼、异齿裂腹鱼和巨须裂腹鱼为一类。除肌肉组织外，心肌、肝脏、肾脏和晶状体4种组织中，尖裸鲤和拉萨裸裂尻鱼的谱带最相似，共有12条酶带；其次是与双须叶须鱼心肌、肝脏和肾脏组织共有8条酶带，晶状体组织共有6条酶带，且共有的酶带多在LDH-B和LDH-B1基因位点处，说明三者中尖裸鲤和拉萨裸裂尻鱼的亲缘关系最近。拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼谱带最相似，共有5条酶带；其次是与巨须裂腹鱼心肌、肝脏和肾脏组织共有5条酶带，晶状体组织共有4条酶带，且共有的酶带多在LDH-B基因位点处，说明三者中拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼亲缘关系较近。从6种裂腹鱼同工酶的表达特征上发现，具有明显种间差异性，在生化水平上已有分化，物种形态上也有所表现，可作为裂腹鱼类分类指标之一。

3.3 LDH同工酶在不同裂腹鱼中的表达与生物演化的探讨

本研究的6种裂腹鱼中，尖裸鲤、拉萨裸裂尻鱼和双须叶须鱼的酶带数显著多于5条(表2)，这与其他裂腹鱼类研究相一致[16-20]。通常，二倍体鱼类中，LDH同工酶由LDH-A、LDH-B基因编码的A、B亚基构成的5条酶带[11]，但在多倍体中重复基因(duplicate gene)的存在和表达、某些位点存在共显性的等位基因(allele gene)或是翻译后化学饰变，共同点是以多条亚带形式出现等情况下，会多于5条带；若存在共显性等位基因，则群体中会出现多态性[11,18，21-22]。6种裂腹鱼中，除双须叶须鱼染色体数2n在400～440之间，高于四倍体外，其他5种裂腹鱼类均为四倍体[22，23]。因此，本研究中尖裸鲤、拉萨裸裂尻鱼和双须叶须鱼的酶谱多于5条酶带是重复基因的表达。

重复基因事件发生后，重复基因一般会经历3个过程：(1)假基因化，即失去功能的重复拷贝；(2)亚功能化，即重复基因通过降解和功能分化使每个拷贝仅保留部分祖先功能，只有当两个拷贝都存在的情况下才能很好地履行祖先基因的功能；(3)新功能化，即获得适应环境的正向选择作用，与祖先基因功能不同的新基因，起初都是以多态的形式在个体中出现，随后沉积于整个群体[24]。Gracia等[25]认为，同工酶酶带数越多的种分化程度越高，是较进化种，同工酶酶带数越少的种分化程度越低，是较原始种。通过对6种裂腹鱼的LDH酶谱比较发现，尖裸鲤、拉萨裸裂尻鱼和双须叶须鱼中存在重复基因LDH-B1，不同的是双须叶须鱼以2条主带间出现一条副带的形式出现，酶带数上尖裸鲤和拉萨裸裂尻鱼最高，说明尖裸鲤和拉萨裸裂尻鱼可能处于重复基因的亚功能化时期，分化程度较高，而双须叶须鱼的分化程度低于尖裸鲤和拉萨裸裂尻鱼；异齿裂腹鱼、拉萨裂腹鱼和巨须裂腹鱼中没有重复基因的表达，酶带数也较少，可能处于重复基因的假基因化时期，分化程度较低，比较原始。

裂腹鱼属为原始等级类群，叶须鱼属为特化等级类群，尖裸鲤属和裸裂尻鱼属为高度特化等级类群[26]，LDH同工酶的演化特点与根据形态学特征所划分的三个类群极为相似。这也说明生物的演化不仅只是表现在形态上，还表现在分子水平上。

[1]武云飞,吴翠珍.青藏高原鱼类[M].成都:四川科学技术出版社,1992:297-515.

[2]张建东,何国清,陈 刚,等.三种鯻科鱼类同工酶组织特异性及群体遗传结构分析[J].湖南师范大学自然科学学报,2015,38(5):27-34.

[3]He S,Mork J.Characteristic LDH isozyme electrophoretic patterns in six flatfish species in the Trondheimsfjord,Norway and their utility for the detection of natural species hybrids [J].Mar Biol Res,2014,11(3):330-334.

[4]Basaglia F.Isozyme distribution of ten enzymes and their loci in South American lungfish,Lepidosirenparadoxa(Osteichthyes,Dipnoi)[J].Comp Biochem Physiol Part B Biochem Mol Biol,2000,126(4):503-510.

[5]Zhigileva O N,Baranova O G,Pozhidaev V V,et al.Comparative analysis of using isozyme and Issr-Pcr markers for population differentiation of Cyprinid fish[J].Turk J Fish Aquat Sci,2013,13(1):159-168.

[6]Janko K,Flaj H,Choleva L,et al.Diversity of European spined loaches (genus Cobitis L.):an update of the geographic distribution of the Cobitis taenia hybrid complex with a description of new molecular tools for species and hybrid determination[J].J Fish Biol,2007,71(Supplement sc):387-408.

[7]韩 庆,赵东海.洞庭湖区不同体色鲇不同组织同工酶的比较研究[J].广东农业科学,2015,4(2):104-107.

[8]胡思玉,彭 垠,赵海涛,等.四川裂腹鱼同工酶研究[J].湖北农业科学,2015,54(18):4540-4543.

[9]陈 见,李 清,王贵英,等.黑尾近红鲌3种同工酶的组织特异性研究[J].安徽农业科学,2015,43(29):49-51.

[10]Ferris S D,Whitt G S.Loss of duplicate gene expression after polyploidisation[J].Nature,1977,265(5591):258-260.

[11]徐钢春,董晶晶,聂志娟,等.刀鲚不同组织的乳酸脱氢酶同工酶及DNA含量研究[J].上海海洋大学学报,2012,21(4):481-488.

[12]晁珊珊,宫佳琦,郑玉才,等.齐口裂腹鱼及草鱼乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶同工酶的比较研究[J].水产科学,2013,32(8):467-470.

[13]姚桂桂,刘 凯,谢 楠,等.黄尾鲴不同组织中LDH同工酶的研究[J].安徽农业科学,2016,44(15):135-137.

[14]唐文家,祁得林,杨 成,等.黄河裸裂尻鱼乳酸脱氢酶同工酶研究[J].水产科学,2008,27(1):39-41.

[15]方 平,王志坚,高 峰.鲇和大口鲇同工酶比较研究[J].西南师范大学学报,2002,27(4):572-575.

[16]李晓莉,许映芳,方耀林,等.齐口裂腹鱼染色体核型和同工酶初步研究[J].淡水渔业,2010,40(1):34-39.

[17]胡思玉,陈永祥,赵海涛,等.昆明裂腹鱼不同组织乳酸脱氢酶同工酶研究[J].贵州农业科学,2010,38(2):140-141.

[18]Chen Y.Electrophoretic analysis of isozymes and discussion about species differentiation in three species of GenusGymnocypris[J].Zool Res,2001,22(1):9-19.

[19]安 苗,范家佑,黄保信,等.乌江上游四川裂腹鱼和昆明裂腹鱼5种同工酶的比较[J].贵州农业科学,2010,38(1):111-115.

[20]李太平,赫广春,赵 凯,等.青海湖裸鲤乳酸脱氢酶的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2001,10(4):7-8.

[21]徐晋麟,马 飞,徐 沁.黄鳝性逆转过程中同工酶的分析研究[J].遗传学报,1994,21(2):104-111.

[22]武云飞,康 斌,门 强.西藏鱼类染色体多样性的研究[J].动物学研究,1999,20(4):258-264.

[23]于祥勇,李渝成,周 暾.中国鲤科鱼类染色体组型研究-8种裂腹鱼亚科鱼类核型研究[J].武汉大学学报,1990,2(2):97-104.

[24]韦若勋,吴莉莉.重复基因和蛋白相互作用的进化[J].黔南民族师范学院学报,2012,6(5):70-74.

[25]Garcia A,Tsunewaki K.Cytogenetical studies in the genusPersea(lauraceae).Ⅲ.Electrophoretical studies on peroxidase isozymes [J].Jap J Genet,1977,52(5):379-386.

[26]代应贵,肖 海.裂腹鱼类种质多样性研究综述[J].中国农学通报,2011,27(32):38-46.

AcomparativestudyonlactatedehydrogenaseisozymesinsixspeciesofSchizothoracinae

WEI Yu-zhong1，ZHANG Gui-rong2，HUO Bin2，XIE Cong-xin2，CHEN Sheng-ao1,2

(1.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,843300Xinjiang,China；2.CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

2016-07-31；

2017-07-10

公益性行业(农业)科研专项(201203086)

魏玉众(1992- )，男，硕士研究生，专业方向为鱼类生物化学。E-mail：weiyuzhongtarim@163.com

陈生熬。E-mail：shengaochen@163.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)05-0003-06