补肾活血方调节miRNA—140—5p表达干预人原代软骨细胞退变的研究

姚楠+陈能+刘文刚+许学猛+黄丹娥+蔡大可+赵传喜

【摘 要】目的：研究补肾活血方含药血清对白细胞介素-1β（IL-1β）刺激的人原代软骨细胞miRNA-140及其靶基因表达的影响。方法：通过采用生理盐水和补肾活血方分别灌胃雌性SD大鼠制备空白血清和含药血清。将人软骨细胞种植于6孔板并且分为3组。空白对照组和模型对照组细胞培养的血清采用大鼠空白血清，含药血清组细胞培养的血清采用大鼠含药血清。另外，模型对照组和含药血清组细胞加入10 ng·mL-1 IL-1β。以上各组细胞设3个复孔，继续培养细胞至IL-1β刺激后24 h收集各组细胞提取总RNA。采用RT-qPCR检测软骨细胞miRNA-140-5p以及聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）、胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表达。结果：与空白对照组比较，模型对照组软骨细胞miRNA-140-5p表达和IGFBP5 mRNA表达明显降低（P < 0.05），ADAMTS-5和MMP-13mRNA表达明显升高（P < 0.05）；与模型对照组比较，补肾活血方含药血清显著升高了IL-1β刺激的软骨细胞miRNA-140-5p表达和IGFBP5 mRNA表达（P < 0.05），并且显著降低ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表达（P < 0.05）。结论：补肾活血方含药血清可以抑制IL-1β导致的人原代软骨细胞退变，其作用机制与提高miRNA-140-5p和IGFBP5 mRNA表达，降低ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表达有关。

【关键词】 骨关节炎，膝；补肾活血方；miRNA-140-5p；软骨细胞

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是全世界最常见的与老龄化相关的退行性关节疾病[1]，使患者产生极大痛苦，给家庭造成沉重负担。中医学认为，KOA发病的病机主要为肾虚血瘀和肾虚络阻。根据补肾、活血、通络和祛风除湿原则筛选中药组成的补肾活血胶囊（后更名为补肾强筋胶囊）为本院院内制剂，多年来的临床及动物实验均证实了其对KOA有良性干预作用[2-5]，但具体作用机制尚不明确。miRNA是广泛存在于真核生物中的一种非编码的小RNA，它主要调控基因转录后水平。大量研究报道表明，miRNA在骨关节炎（osteoarthritis，OA）发病过程中软骨细胞增殖、凋亡以及软骨基质合成与分解代谢等方面发挥了重要的调控作用，其中miRNA-140在维持软骨正常代谢即维持软骨基质稳态的过程中起重要

作用[6-7]。

本实验采用白细胞介素-1β（IL-1β）作为造模剂在体外复制出退变的软骨细胞模型，研究了补肾强筋胶囊含药血清对IL-1β刺激的软骨细胞miRNA-140-5p及其靶基因聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）、胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表达的影响，从miRNA角度探讨其治疗KOA的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠10只，体质量180～220 g，购自广东省医学实验动物中心，实验动物中心生产许可证号：SCXK（粤）2013-0002。

实验动物质量合格证号：NO44007200021993。本研究在广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）SPF级动物实验室进行，设施使用许可证号：SYXK（粤）2015-0059。

1.2 实验仪器 ClassⅡType B2型生物安全柜（新加坡Esco公司）；DMI8型倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；Cellometer Mini型自动细胞计数仪（美国Nexcelom公司）；BSA224S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；5424型小型高速离心机（德国Eppendorf公司）；Milli Q Plus型超级纯水仪（美国Millipore公司）；702型超低溫冰箱（美国Thermo Scientific公司）；Smart-Spec plus 型核酸蛋白测定仪（美国Bio-Rad公司）；ViiA7型实时荧光定量PCR系统（美国Thermo公司）。

1.3 药物和试剂 本研究所用的补肾强筋胶囊由广东省第二中医院制剂室提供（生产批号20161003）；高糖DMEM培养基（美国Gibco公司，生产批号8116358）；澳洲胎牛血清（美国Corning公司，生产批号35076116）；胰蛋白酶（美国Gibco公司，生产批号1846496）；DPBS（美国Corning公司，生产批号21031489R）；重组人IL-1β试剂（美国Peprotech公司，生产批号0909AFC95A0616）；Trigol试剂（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，生产批号50T00150）；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Thermo Scientific公司，生产批号00182216）；MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（美国Thermo Scientific公司，生产批号00361271）；相关引物（上海英潍捷基贸易有限公司）。

2 方 法

2.1 含药血清制备 10只SD雌性大鼠在SPF级动物实验室适应性喂养1周后，按体质量随机分组法分为给药组和正常对照组，每组5只。参考《中药药理研究方法学》中的“体表面积比”换算方法换算出动物的临床等效剂量作为给药剂量。给药组采用0.243 g·kg-1生药进行灌胃[8]；正常对照组则给予等体积的生理盐水进行灌胃。所有大鼠连续灌胃7 d，最后一次给药后1 h，采用巴比妥钠注射麻醉后进行大鼠腹主动脉取血，离心机3000 r·min-1离心血样5 min，吸取上清液，于56 ℃灭活30 min后采用0.45 μm滤膜抽滤除菌，分装后放置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。endprint

2.2 细胞培养和造模 收集在本单位骨科手术室进行膝关节置换手术的患者（年龄65岁以上）的关节软骨，迅速转移至细胞培养室，按照本实验室的传统做法[8]分离和培养人原代软骨细胞。将培养的第2代人软骨细胞按每孔3×105个细胞种植于细胞培养6孔板，继续培养至细胞融合度达到80%左右时弃去培养基，并且用DPBS洗2次后，分为以下3组：空白对照组只添加高糖DMEM培养基和10%大鼠空白血清；模型对照组添加高糖DMEM培养基和10%大鼠空白血清，并且加入10 ng·mL-1 IL-1β；含药血清组添加高糖DMEM培养基和10%大鼠含药血清，并且加入10 ng·mL-1IL-1β。以上各组细胞设3个复孔，继续培养24 h后收集各组细胞。

2.3 反转录合成First-strand cDNA 首先采用Trigol，氯仿，异丙醇和75%乙醇等试剂提取软骨细胞总RNA，然后将RNA反转录合成第一链cDNA。其中U6和miRNA-140-5p的First-strand cDNA合成中分别加入各自的RT引物，ADAMTS-5和MMP-13的First-strand cDNA合成中加入随机引物。基因引物设计利用Primer 6.0生物软件，分别设计了U6，扩增片段大小为89 bp；miRNA-140-5p，扩增大小为64 bp；GAPDH（基因序列号：M33197），扩增片段大小为105 bp；ADAMTS-5（基因序列号：NM_007038），扩增片段大小为113 bp；IGFBP5（基因序列号：NM_002427），扩增片段大小为241 bp；

MMP-13（基因序列号：NM_002427），扩增片段大小为183 bp。相关的引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成，具体的引物信息见表1。

2.4 基因表达的检测 将灭菌超纯水9.5 ?L，相關前引物和后引物（终浓度均是1 ?M）各1 ?L，cDNA 1 ?L，MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）12.5 ?L混合后共25 ?L体系放入定量PCR仪进行扩增。步骤1：94 ℃预变性5 min；步骤2：94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，

72 ℃延伸50 s，共45个循环。步骤3：72 ℃延伸7 min。扩增反应结束后进行产物熔解曲线分析。最终运用2-△△Ct法计算各组基因相对表达量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对所有数据进行统计学分析。计量资料以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间均数两两比较，方差齐时采用SNK法；方差不齐时采用Dunnett's T3法。当P < 0.05时认为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 补肾强筋胶囊含药血清对软骨细胞miRNA-140-5p表达的影响 与空白对照组比较，模型对照组软骨细胞miRNA-140-5p表达明显降低；与模型对照组比较，补肾强筋胶囊含药血清显著升高软骨细胞miRNA-140-5p表达。见表2、图1、图2。

3.2 补肾强筋胶囊含药血清对软骨细胞ADAMTS-5、IGFBP5和MMP-13 mRNA表达的影响 与空白对照组比较，模型对照组软骨细胞ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表达均明显升高（P < 0.05），而IGFBP5 mRNA表达明显下降（P < 0.05）；与模型对照组比较，补肾强筋胶囊含药血清显著降低ADAMTS-5和MMP-13 mRNA表达（P < 0.05），并且显著提高IGFBP5 mRNA的表达（P < 0.05）。见表3。

4 讨 论

关节软骨主要由软骨细胞及其细胞外基质组成，通常情况下软骨细胞的细胞外基质合成和分解代谢处于动态平衡，从而维持软骨细胞稳态。一旦软骨细胞代谢失衡，细胞外基质降解加剧将引起软骨退变，导致KOA发病。miRNAs是一类由内源基因编码的长度为20～22个核苷酸的非编码蛋白单链小RNA家族，通常通过影响靶基因的转录和翻译，进而影响细胞的功能[9]。目前研究表明，miRNAs在KOA的发病过程中起重要作用[10]，其中miRNA-140在维持软骨基质稳态方面的作用尤为明显[6-7]。miRNA-140在小鼠关节软骨中表达明显高于其他组织，并且在OA软骨中的表达明显低于正常软骨[11-12]。另外，细胞炎症因子是KOA发病进程中重要的致病因素，其中与KOA发病密切相关的是IL-1β，它是导致关节软骨代谢失衡，促进软骨基质降解进而破坏关节软骨的主要细胞因子[13]。已有研究表明，IL-1β的刺激可以明显降低体外培养的关节软骨细胞miRNA-140的表达，这说明IL-1β诱导的体外软骨细胞退变模型和临床上的OA很类似，均以miRNA-140表达的显著降低为主要特征。

在软骨细胞外基质合成代谢中，胰岛素样生长因子-1（IGF-1）合成代谢细胞因子，可以减少关节软骨的破坏，IGFBP5则可以调控其活性，与IGF-1的含量呈正相关。Tardif等[14]通过转染miRNA-140以及抗miRNA-140分别处理OA软骨细胞，证实了miRNA-140是IGFBP5的靶基因。在软骨细胞外基质分解代谢中，引起软骨细胞外基质降解的蛋白酶包括ADAMTS-5，它主要降解蛋白聚糖[15]；还包括MMP-13，它主要降解Ⅱ型胶原蛋白。Trzeciak等[16]发现，miRNA-140可以抑制ADAMTS-5的表达，从而缓解蛋白聚糖减少为特征的OA。Liang等[17]发现，miRNA-140可以负反馈调节IL-1β刺激的人软骨C28/I2细胞系中MMP-13的表达。荧光素酶报道基因实验进一步证实了ADAMTS-5和MMP-13都是miRNA-140的靶基因。

本研究首先制备了院内制剂补肾强筋胶囊的含药血清，然后运用该含药血清干预IL-1β刺激的体外人软骨细胞退变模型，重点研究了miRNA-140及软骨代谢相关靶点基因表达的变化。endprint

结果发现和文献报道一致，IL-1β的刺激导致人原代软骨细胞miRNA-140-5p表达和IGFBP5 mRNA表达明显降低，同时ADAMTS-5、MMP-13 mRNA表达明显升高[12]。而补肾活血方含药血清可以显著提高软骨细胞miRNA-140-5p表达及IGFBP5 mRNA表达，明显降低ADAMTS-5、MMP-13 mRNA表达水平，这表明其治疗KOA的作用机制与调控miRNA-140进而维持软骨细胞稳态密切相关。该研究首次在人原代软骨细胞miRNA层面探讨了补肾活血方对软骨代谢的影响，为全面阐释其治疗KOA的作用机制奠定了基础。然而，该补肾活血方是否还调控其他miRNAs从而干预KOA，值得深入研究。

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