混菌发酵消减大米中镉的工艺优化

陈 瑶 廖卢艳 吴卫国

(湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128)

混菌发酵消减大米中镉的工艺优化

陈 瑶 廖卢艳 吴卫国

(湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128)

以镉含量为0.977 8 mg/kg的超标大米为原料，脱镉率为衡量指标，利用单因素试验和Box-behnken中心组合试验对罗伊氏乳杆菌+发酵乳杆菌+植物乳杆菌(体积比=1∶1∶1)发酵消减大米中镉的工艺条件进行优化，重点考察发酵温度、发酵时间、大米粒度、料液比、接种量对脱镉率的影响。结果表明：罗伊氏乳杆菌+发酵乳杆菌+植物乳杆菌(体积比=1∶1∶1)发酵消减大米中镉的最佳工艺条件为大米粒度40目，接种量3%，料液比1∶5 (g/mL)，温度37 ℃，时间21 h，该工艺条件下脱镉率可达到89.98%，与模型预测值(89.736 2%)相近。

镉；大米；乳酸菌；发酵

Abstract： Rice with cadmium content of 0.977 8 mg/kg was studied as the main material, its cadmium removal rate was regard as the basic measuring index. The process parameters of reducing techniques for cadmium-tainted rice were optimized by single factor test and Box-behnken response surface design. The investigation were focused on the effects of temperature, time, mesh number of rice, solid-liquid ratio, and inoculation amount. The optimal parameters were found as follows: mesh number of rice 40, inoculation amount 3, solid-liquid ratio 1∶5, treated at 37 ℃ for 21 h. Under this optimum conditions, the cadmium removal rate was 89.98%, which was similar to the predicted value of 89.736 2%.

Keywords： Cadmium; rice; lactobacillus; fermentation

近年来，“镉大米”的出现引发了人们对大米食用安全性的担忧与焦虑。另外，因镉大米存在的安全问题而造成了大量粮食资源的浪费。防治大米镉污染的根本途径即从源头出发，修复镉污染稻田及水源。选育镉富集能力低的水稻也是减轻大米镉污染的有效手段[1]。但这些技术的推广和普及在短期内难以实现。通过加工技术实现大米脱镉，是解决镉超标大米利用问题的应急之策，有利于稻米行业的健康发展和粮食安全[2]。研究[3-4]表明，通过砻谷、碾米和浸泡等物理方法均能降低大米中的镉含量，物理法设备简单、成本低，但脱镉率较低。田阳[3]发现镉含量高于0.323 mg/kg的镉超标稻谷很难通过简单的砻谷碾米等物理方式使镉含量降低至达标。化学法能取得较好的脱镉效果，但经过酸式或碱式浸提得到的脱镉大米制品应用范围窄，还有可能造成化学残留[5-6]。微生物法在大米镉脱除方面前景广阔，一方面，针对镉超标严重的大米，采用微生物法可以有效脱镉，为富镉米的深加工及综合利用提供了有效转化途径；另一方面，经过微生物发酵作用还可以提升大米的口感和品质[7-8]。目前的微生物脱镉研究主要围绕单一菌种展开，如植物乳杆菌、发酵乳杆菌、长双歧乳杆菌等[9-10]。而多菌种发酵的优势明显优于单一菌种，很多重要的化学反应仅靠纯种发酵是无法顺利进行的，采用混菌发酵可以弥补单一菌种发酵不足的缺点[11-14]。此外，由于混菌发酵过程中代谢产物更为丰富，混菌发酵脱镉效率可能会提高。

本研究结合了微生物脱镉和混菌发酵的优势，以镉超标大米为原料，选用植物乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌4种常用于食品工业的益生菌复配成发酵剂，消减大米中的镉，通过对比试验选择具有最佳脱镉能力的菌种组合，利用响应面法优化获得发酵脱镉的最佳工艺参数，以期为镉超标稻米的治理和用途转换提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米：早籼米(镉含量0.977 8 mg/kg)，产地湖南省株洲县；

鼠李糖乳杆菌冻干粉、植物乳杆菌冻干粉：广东环凯微生物科技有限公司；

罗伊氏乳杆菌冻干粉、发酵乳杆菌冻干粉：中国食品发酵工业研究院；

硝酸、高氯酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；

镉标准储备液：1 000 μg/mL，中国计量科学院；

MRS培养基、MRS肉汤：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌锅：LDZX-50KB型，上海申安医疗器械厂；

无菌操作台：SW-CJ-IFD型，苏州佳宝净化工程设备有限公司；

生化培养箱：SPX-250BS-Ⅱ型，上海新苗医疗器械制造有限公司；

台式离心机：TD5A型，湖南赫西仪器装备有限公司；

电热鼓风干燥箱：101A-3ET型，天津市泰斯特仪器有限公司；

电子天平：BS201S型，北京赛多利斯天平有限公司；

原子吸收分光光度计：AA-7000型，日本岛津有效公司；

不锈钢数显电热板：DB-1型，北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化及菌悬液的制备

(1) 冻干菌种的复活：在无菌条件下开启装有菌种的安瓿管，加入复苏液(MRS肉汤)，轻轻旋转安瓿管，将冻干菌种粉制成悬浮液，然后用移液枪吸取适量菌液，移至灭菌的MRS液体培养基，在36 ℃下培养24～48 h，直至液体培养基浑浊。

(2) 菌悬液的制备：无菌条件下制备一系列稀释度的菌液接种至灭菌的MRS琼脂平板上，37 ℃恒温培养24 h，采用稀释平板计数对菌落计数，稀释至浓度达到109CFU/mL即可。

1.3.2 大米粉发酵

(1) 大米粉样品的制备：大米除杂后，用粉碎机粉碎，依次通过100，80，60，40，20目的标准筛，分别分装编号。排气密封后存放在阴凉、干燥、易通风处，备用。

(2) 发酵大米粉的制作工艺：准备20～70 mL的超纯水置于锥形瓶中灭菌(121 ℃，20 min)，准确称量10.00 g过筛的大米粉样品置于已灭菌的去离子水中，充分混合均匀。再将不同比例混合的乳杆菌菌悬液(植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)接种到大米浆液中，菌悬液的接种量为1%～6%。用封口膜将锥形瓶密封后置于20～40 ℃恒温培养箱中发酵12～32 h。空白组不接种，加入等量的0.3%的苯甲酸钠于恒温培养箱35 ℃浸泡发酵21 h[15]。待发酵完毕后倒去发酵液，用去离子水清洗4次，将发酵后的米粉转入离心管中，再用40 mL的去离子水洗涤锥形瓶4次，洗液合并于离心管中。用离心机脱水(3 000 r/min，5 min)，脱水后的大米粉置于55 ℃的热风干燥箱中干燥至恒重，再用自封袋密封后置于冰箱4 ℃保存备用。

1.3.3 大米中镉含量的测定

(1) 样品消解：称取干大米试样0.3～0.5 g(精确至0.000 1 g)，采用湿法消解，消解液为10 mL硝酸—高氯酸混合溶液(体积比为9∶1)，待消解完毕后将消化液转移至容量瓶，用1%的硝酸溶液定容至刻度，同时做空白试验[16]2-3。

(2) 标准曲线的绘制：调整原子吸收分光光度计至最佳状态，参数条件：波长228.8 nm，狭缝宽度0.7 nm，灯电流8 mA，灰化温度550 ℃，灰化时间30 s，原子化温度1 800 ℃，原子化时间3 s[18]3。配制含镉量分别为0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 ng/mL的标准系列溶液，注入20 μL的标准系列溶液和5 μL的基改剂溶液(10 g/L磷酸二氢铵溶液)于石墨炉中，测其吸光度值，得到吸光值与镉浓度的标准曲线(见图1)，平行测定3次，结果取平均值。

图1 镉标准曲线

(3) 样品中镉含量的测定：吸取20 μL的样品消化液和5 μL的基改剂溶液(10 g/L磷酸二氢铵溶液)于石墨炉中，测其吸光值，按式(1)求出样品中的镉含量，平行测定3次，结果取平均值。

(1)

式中：

X——试样中镉含量，mg/kg；

C1——试样中消化液中的镉含量，ng/mL；

C0——空白液中的镉含量，ng/mL；

V——试样消化液定容总体积，mL；

m——试样质量，g；

1 000——换算系数。

1.3.4 大米脱镉率 按式(2)计算：

(2)

式中：

X——脱镉率，%；

W0——原料大米中镉的含量， mg/kg；

W1——发酵脱镉后大米中镉的含量，mg/kg。

1.3.5 发酵剂脱镉效果的比较

(1) 单菌脱镉效果：在相同试验条件下 [大米目数20目，发酵温度35 ℃，发酵时间25 h，料液比1∶4 (g/mL)，接种量3%]，选取发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌，以脱镉率为考察指标，研究各菌种单独脱除大米中重金属镉的效果。

(2) 混菌脱镉效果：在相同试验条件下[大米粒度20目米，发酵温度35 ℃，发酵时间25 h，料液比1∶4 (g/mL)，接种量3%]，选取植物乳杆菌分别与发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌按体积比1∶1，2∶1混合复配成两菌型发酵剂，植物乳杆菌与发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌依次组合复配成三菌型发酵剂(体积比1∶1∶1)，以脱镉率为考察指标，研究混菌发酵剂脱除大米中重金属镉的效果。

每个试验重复3次，试验数据均以平均值±标准偏差表示。通过对比试验，选取脱镉效果最好的菌种或菌种组合作为后续试验的发酵剂。

针对在建设工程项目管理工作中存在的问题，企业应实行定员定岗的岗位工作责任制。将企业控制成本的工作责任落实到涉及工程建设项目的每一个人身上。例如：负责合同拟定和管理的部门要与业主和各级部门做好合同内容的沟通工作，明确合同各条款内容。对存在争议的部分要及时作出有效的沟通。施工内容或者材料价格变更时要及时与业主沟通，划分好责任。施工人员对施工工艺和施工设备进行统一的管理，确保施工工作正常有序的进行。这样将责任细化分配给各个岗位的工作者，不仅可以增加施工工程的工作效率，也可以有效的将责任与成本结合起来，达到控制成本的目的。

1.3.6 单因素试验设计 单因素试验采用以下试验操作进行，选取上一步得到的脱镉效果最好菌种组合：罗伊氏乳杆菌∶发酵乳杆菌∶植物乳杆菌(体积比1∶1∶1)作为发酵剂，以脱镉率为指标，每个试验做3次平行试验，试验数据均以平均值±标准偏差表示。

(1) 温度：固定大米粒度20目，发酵时间25 h，料液比1∶4 (g/mL)，接种量3%，发酵温度分别为20，25，30，35，40 ℃，研究发酵温度对脱镉率的影响。

(2) 时间：固定大米粒度20目，发酵温度37 ℃，料液比1∶4 (g/mL)，接种量3%，发酵时间分别为12，16，20，24，28，32 h，研究发酵时间对脱镉率的影响。

(3) 目数：固定发酵温度37 ℃，发酵时间25 h，料液比1∶4 (g/mL)，接种量3%，大米粒度分别为20，40，60，80，100目，研究大米目数对脱镉率的影响。

(4) 料液比：固定大米粒度20目，发酵温度37 ℃，发酵时间25 h，接种量3%，料液比分别为1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7 (g/mL)，研究料液比对脱镉率的影响。

(5) 接种量：固定大米粒度20目，发酵温度37 ℃，发酵时间25 h，料液比1∶4 (g/mL)，接种量分别为1%，2%，3%，4%，5%，6%，研究接种量对脱镉率的影响。

1.3.7 响应面试验设计 根据单因素试验结果，选取料液比、温度、时间为自变量，以脱镉率为响应值。根据 Box-Behnken Design中心组合试验设计原理，运用Design Expert 8.0.6软件设计3因素3水平响应面试验，并对试验数据进行分析优化，得出大米发酵降镉的最佳工艺。

2 结果与分析

2.1 发酵剂脱镉效果的比较

由表1可知，混菌发酵的脱镉效果明显优于纯种发酵脱镉的效果，以三菌混合发酵脱镉效果最佳。其中脱镉效果最佳的菌种组合为罗伊氏乳杆菌∶发酵乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1∶1 (体积比)，脱镉率可达(88.46±0.45)%，因此选择该混合菌种，作为后续试验的发酵剂。混菌发酵效果较好的原因是混菌发酵利用了不同菌株作用效果的差异，具有多菌共生酶系互补的特点，使得混菌发酵产酶和产酸能力远高于单一菌株，并能克服中间产物过大对发酵产物生成的不良影响[17-18]。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 温度对脱镉率的影响 由图 2可知，20 ℃时的脱镉率最低，随着温度的升高脱镉率逐渐升高，在35 ℃时脱镉率达到最高值，之后脱镉率明显下降，说明过高和过低的温度都不利于大米中重金属镉的去除。乳酸菌发酵脱除大米中的镉主要是依靠微生物代谢产物——乳酸、蛋白酶等的作用，同时菌体本身对重金属也有吸附作用[19-20]。低温时脱镉率较低可能是低温时乳酸菌生长缓慢，其代谢产物也较少，不利于镉的溶出。而高温导致大量菌体自溶，乳酸菌的活菌数大量下降，削弱了微生物及其代谢产物对镉的淋滤作用[21]。此外，微生物分泌的胞外聚合物存在大量具有重金属亲和性的阴离子基团，温度过高使胞外聚合物的活性降低，导致重金属的吸收效率变低[22]。因此选择35 ℃为中心点进行后续试验。

表1 发酵剂脱镉效果的比较†

† 括号内为体积比。

2.2.2 时间对脱镉率的影响 由图3可知，随着发酵时间的延长，脱镉率也随之增加，当发酵时间达到24 h之后，脱镉率增加趋势变缓。可能是在发酵前期，随着微生物大量生长繁殖，代谢产物大量累积，游离态的镉溶出速度较快，大量结合态的镉也随着发酵的进行逐渐溶出，脱镉率随之上升；当发酵时间继续延长，乳酸菌的活菌数量逐渐下降，镉的溶出逐渐接近饱和状态，脱镉率则增加缓慢。同时，随着发酵时间的延长，发酵液的pH也越来越低，过低的pH环境影响了金属离子与吸附活性点位的接触，不利于微生物对重金属的吸附[23-24]。由于24 h之后的脱镉率增加幅度不明显，考虑到经济效益，选择20 h为中心点进行后续的试验。

相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在P<0.01水平上差异不显著

相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在P<0.01水平上差异不显著

2.2.3 大米目数对脱镉率的影响 由图4可知，脱镉率随大米目数的增加总体变化趋势不大。当大米目数为20目时，脱镉率最低，随着大米粉越来越细，脱镉率先增加后下降。可能是大米目数变大，加速了微生物脱镉的反应速率，有利于游离态镉的溶出；但大米粉粒度继续降低，米粉的粒度过小，溶液的黏度增大，减弱了游离态镉向外溶出的速率。因此在之后的试验中固定大米粒度为40目。

相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在P<0.01水平上差异不显著

2.2.4 料液比对脱镉率的影响 由图5可知，随着料液比的增加，脱镉率先升高后下降。当料液比较小时，脱镉率也相对较低，可能是去离子水的用量较小，发酵液的pH偏小，大米中淀粉大量水解，可溶性物质大量溶出，此时溶液的黏度较大，影响了金属离子与吸附活性点位的结合，导致镉溶出比较困难[25-26]。随着料液比的增大，发酵液的pH随之增加，加快了镉的溶出，然而当料液比继续增加会稀释发酵液的浓度，同时微生物的代谢产物体积分数随之下降。因此选择料液比1∶5 (g/mL)为中心点进行后续的响应面优化。

相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在P<0.01水平上差异不显著

2.2.5 接种量对脱镉率的影响 由图6可知，随着接种量的增加，脱镉率先增加后下降。接种量较小时，初始活菌数较少，微生物代谢产物的积累也较少，从而不利于镉的脱除；随着接种量的增加，镉脱除率逐渐升高。但继续增加接种量，脱镉率并未继续升高。因为当接种量过大时，菌体生长环境中可供利用的营养物质有限，菌种之间产生竞争，生长繁殖的速率减慢，使得镉脱除的效率也随之缓慢下降[26]。因此，后续试验接种量固定为3%。

相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在P<0.01水平上差异不显著

2.3 响应面试验结果与分析

2.3.1 响应面分析试验结果 响应面因素设计水平见表2。运用Design Expert 8.0.6软件，对表3中的试验数据进行多元回归分析，得到脱镉率与所选3个因素的回归方程为：

Y=88.99+0.58A+2.37B+2.13C+0.31AB+2.68AC-1.67BC-7.09A2-2.64B2-3.40C2，

(3)

2.3.2 响应面交互作用分析 由图7可知，料液比和发酵温度之间的交互作用等高线图呈圆形，说明两者交互作用不是很显著。由图8可知，发酵时间对脱镉率的影响大于料液比，且发酵时间与料液比之间的等高线图呈椭圆形，说明两者之间存在较强的交互作用。由图9可知，发酵温度对脱镉率的影响略大于发酵时间，且两者之间存在较强的交互作用。

2.3.3 最优工艺条件的确定与验证 在各因素选定范围内，对回归模型进行分析优化，得到的大米发酵脱镉最佳工艺条件为：料液比1∶5.1 (g/mL)，温度36.86 ℃，时间21.04 h，在此条件下预测脱镉率为89.736 2%。为验证此方法的结果，并考虑实际可操作性，将最佳工艺参数修正为：料液比1∶5 (g/mL)，温度37 ℃，时间21 h。并进行3次平行实验，脱镉率分别为89.85%，90.01%，90.08%。实际脱镉率平均值为89.98%，与模型拟合良好，说明该模型能够较好地预测大米发酵脱镉的效果。

表2 响应面试验设计因子水平表

表3 响应面试验设计与结果

表4 回归模型方差分析†

† **表示P<0.01，差异极显著； *表示P<0.05，差异显著。

图7 料液比和温度交互影响脱镉率的等高线图及曲面图

图8 料液比和时间交互影响脱镉率的等高线图及曲面图

图9 温度和时间交互影响脱镉率的等高线图及曲面图

3 结论

本试验对混菌发酵的脱镉效果进行了研究，发现混菌发酵的脱镉效果明显比单菌纯种发酵的效果好，脱镉率最高菌株组合即罗伊氏乳杆菌+发酵乳杆菌+植物乳杆菌 (体积比1∶1∶1)。通过响应面优化了乳酸菌混合发酵消减大米中镉的工艺条件为：大米目数40 目，接种量3%，料液比1∶5 (g/mL)，温度37 ℃，时间21 h，在此工艺条件下脱镉率可达到 89.98%，与模型预测值89.736 2%相近。空白组未进行发酵的大米镉脱除率仅为4.38%。

本研究虽获得了较好的脱镉效果，但其脱镉机制还有待进一步研究。近年来，关于微生物脱除重金属的研究尚处于起步阶段。为了加速微生物脱镉技术在大米脱镉中的应用，还需要进一步了解脱镉菌株的生理特征，代谢产物对脱镉率的影响，以及各种发酵参数之间的关系。进一步优化工艺条件，尽可能地提高脱镉菌种的利用效率。

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Optimization of the technology for reducing cadmium in rice by mixed fermentation

CHEN YaoLIAOLu-yanWUWei-guo

(CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.011

2017年湖南省研究生科研创新项目(编号：CX2017B375)；农业部、财政部专项(编号：农办财函 [2016] 6号)

陈瑶，女，湖南农业大学在读硕士研究生。

吴卫国(1968—)，男，湖南农业大学教授，博士。 E-mail: 1061051403@qq.com

2017—05—04