甲乙煎改善肝纤维化大鼠肝细胞的实验研究*

王卫华

河北省邯郸市传染病医院肝五科 (河北 邯郸， 056002)

甲乙煎改善肝纤维化大鼠肝细胞的实验研究*

王卫华

河北省邯郸市传染病医院肝五科 (河北 邯郸， 056002)

目的：观察中药甲乙煎对实验性肝纤维化大鼠肝组织炎症活动度和肝纤维化程度及肝细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达水平的影响。方法60只大鼠除正常组10只外，其余50只通过腹腔注射DMN(二甲基正硝胺)建立肝纤维化大鼠模型。造模成功的30只大鼠随机分为3组(模型组、甲乙煎高剂量、低剂量组各10只)，甲乙煎高、低剂量组大鼠分别给予22g/kg.d和5.5 g/kg·d甲乙煎药汁灌胃治疗；正常组和模型组大鼠灌胃生理盐水，共4W。结果甲乙煎高剂量组、甲乙煎低剂量组大鼠肝组织炎症活动度和肝纤维化程度明显降低，尤其是甲乙煎高剂量组大鼠肝组织肝纤维化程度降低最明显，与甲乙煎低剂量组、模型组比较差异有显著性意义(P<0.05)。高、低剂量甲乙煎不能下调肝纤维化大鼠肝细胞内MMP-2 的阳性表达，与模型组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。结论：甲乙煎能明显改善肝纤维化大鼠肝组织炎症活动度和肝纤维化程度，但它不是通过下调肝细胞基质金属蛋白酶-2来改善肝纤维化的。

关题词甲乙煎；肝纤维化大鼠模型；实验研究

AbstractObjective: To Observe the effects of Jiayijian on the expression level of MMP2 in the hepatocytes of rats with hepatic fibrosis, as well as its impact on the grade of inflammation and the degree of hepatic fibrosis.Methods:After successfully establishing the hepatic fibrosis rats model based on some latest research reports, the rats were divided into normal control groups(10) and model groups(30). And then the 30 rats of model group were randomly divided into another 3 groups (model control group, the low and high dosage of Jiayijian group). The rats of the high and low dose groups were given Jiayijian at dosage of 22g/kg/d and 5.5g/kg/d by gavage for 4 weeks. The normal control and model control groups were given, according to requirements, the same volume of 0.9% sodium chloride injection by gavage once a day for 4 weeks as well.Results: For the low and high dosage of Jiayijian groups, the degree of rat liver tissue inflammation , fibrosis grade scores reduced after treatment. In particular, Compared with the hepatic fibrosis model control group and the low dose group, the difference were significant in the high dose group(P<0.05). the low and high dosage of Jiayijian cannot down-regulate the expression of MMP2. Compared with model control group , the difference was no significant in the high and low dose group(P>0.05).Conclusion: Chinese medicine Jiayijian may relieve the inflammation and inhibit fibrosis in hepatic tissue of experimental rats with hepatic fibrosis, and thereby play a role in improving the degree of hepatic fibrosis, But cannot down-regulate the expression of MMP2.

Keywords: Jiayijian; hepatic fibrosis model; experimental research

肝纤维化是由多种病因导致的慢性肝病共有的病理改变，以细胞外基质在肝内过度沉积为病理特征，是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径[1]。多年来我院使用经验方“甲乙煎”抗肝纤维化取得了满意的临床疗效。我们通过注射二甲基亚硝胺(DMN)建立大鼠肝纤维化动物模型，观察中药甲乙煎对DMN导致的大鼠肝纤维化的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性清洁级Wister大鼠60只，体质量(200±20)g，由河北医科大学动物中心提供，实验动物合格证号：603036。按清洁级标准饲养，每只大鼠喂饲料50g/d，充足饮水，相对湿度60%，温度20℃，动物饲料由河北医科大学动物中心提供。

1.2 药品及试剂 甲乙煎由茵陈、茯苓、薏苡仁、佩兰、泽泻、郁金、柴胡、连翘、生甘草按3∶3∶3∶1∶1∶1∶1∶1∶1组成。由河北医科大学附属第四医院中药制剂室制成流浸膏，每毫升药液含生药2.5g。二甲基亚硝胺(DMN)由东京化成工业株氏会社提供(批号：MAL05)。

1.3 主要仪器 奥林巴斯光学显微镜BX41(OLYMPUS公司)；BM-Ⅱ型病理组织包埋机(安徽电子科学研究所)；303-4A数显电热保温箱(上海阳光实验仪器有限公司)；CS-Ⅱ型摊片烤片机(孝感市宏业医用仪器有限公司)。

1.4 动物分组及模型制备 60只大鼠除正常组10只外，其余50只每周连续3日腹腔注射DMN 10mg/kg·d，共4周造模，首次用量减半。造模结束后随机抽取1只大鼠做肝脏病理切片，证实有假小叶形成，为肝纤维化4级。造模时19只大鼠死亡，故有30只大鼠进入下一步实验。

1.5 分组及给药方法 30只模型大鼠随机分为3组(模型组、甲乙煎高、低剂量组)每组10只，甲乙煎高、低剂量组大鼠分别给予22g/kg·d和5.5 g/kg·d甲乙煎灌胃治疗，灌胃容量为3毫升，模型组和正常组大鼠给予等容量的0.9%氯化钠注射液灌胃，共4周。

1.6 观察项目 末次给药次日，空腹处死全部大鼠，取肝左叶组织部分，用10%中性福尔马林固定24h，石蜡包埋切片，免疫组化法检测大鼠肝细胞MMP-2的表达，光镜下观察各组大鼠肝组织炎症活动度和肝纤维化程度。

1.7 判定标准 大鼠肝组织MMP-2的蛋白表达均在细胞浆内，根据着色程度及着色细胞百分率进行计算：不着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；着色细胞计数阳性细胞百分率5%以下为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，>51%为3分，每张切片着色程度与着色细胞百分率得分，0～1分阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6分及以上为强阳性(+++)。参照王泰龄等慢性肝炎炎症活动度和肝纤维化评定标准计分[2]。

1.8 统计学方法 采用SPSS13.0统计软包进行分析，计数资料组间比较采用秩和检验，以P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝组织的肉眼观察情况 正常组大鼠肝脏外观红润，表面光滑，质地柔软；模型组大鼠肝脏外观偏小，呈黄褐色，表面粗糙，部分见细小结节，质地较脆；甲乙煎高、低剂量组大鼠肝脏外观呈褐色，表面粗糙，部分偶见细小结节，质地偏硬。

2.2 各组大鼠肝组织的显微镜观察情况 Masson染色(纤维染绿)示：正常组大鼠肝组织无胶原纤维增生；模型组大鼠肝组织汇管区大量胶原纤维和网状纤维增生，形成纤维间隔包裹假小叶；甲乙煎高剂量组大鼠在汇管区与肝窦见少量绿色胶原纤维；甲乙煎低剂量组大鼠在汇管区与肝窦有较多绿色胶原纤维，相对模型组较少。见插页图12.3 各组大鼠肝组织炎症活动度、纤维化情况 经秩和检验，甲乙煎高、低剂量组大鼠炎症活动度与模型组比较，差异均有显著性意义(P<0.05)，且甲乙煎高剂量组大鼠肝组织炎症活动度改善方面优于甲乙煎低剂量组(P<0.05)；甲乙煎高剂量组大鼠肝组织纤维化程度与模型组比较，差异有显著性意义(P<0.05)，而甲乙煎低剂量组与模型组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组大鼠肝组织炎症活动度、纤维化程度比较 (n)

2.4 各组大鼠肝组织MMP-2表达情况 见表2、插页图2。

表2 各组大鼠肝组织的MMP-2的表达比较(n)

与正常组比较，**P<0.05，与模型组比较，△P>0.05

3 讨 论

现代医学认为，肝纤维化是各种慢性肝病病情进展的一个共同的病理环节，以肝星状细胞的活化和细胞外基质大量生成和过度沉积为主要特征[3]。在肝内参与细胞外基质(ECM)降解的酶系为MMPs，MMPs是一类含有锌原子其活性依赖于钙离子的蛋白酶，可以降解ECM中的主要大分子[4],其中MMP-2又称明胶酶A，系Ⅳ型胶原酶, MMP-2在肝星状细胞肝窦内皮细胞﹑库普弗细胞均有表达，MMP-2活化后能降解I、 III型胶原(明胶)、IV型、V型天然胶原分子和纤维连结蛋白等，在肝纤维化时MMP-2表达明显增强。

肝纤维化属中医学积聚、鼓胀、黄疸等范畴，是各种外感、内伤因素损伤肝脏日久而致，湿热疫毒和正气不足是主要发病因素。其中肝病传脾是重要的病理环节。甲乙煎是刘亚娴教授治疗肝病的基础方剂，参考王旭高、秦伯未等古今医家治疗肝病的理论与经验而拟定，中医理论认为肝病传脾是重要的病理环节，《金匮要略》曰 “见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。本方突出体现了上述治疗原则。基本药物由茯苓、苡仁、佩兰、泽泻、茵陈、柴胡、郁金、连翘、生甘草等组成，全方重在健脾化湿、疏肝和胃、调理气机，佐以解毒。以茯苓、薏仁、佩兰、泽泻健脾化湿为君，茵陈、柴胡疏肝，郁金理气为臣，连翘(或加公英)解毒为佐，生甘草解毒和中，调和诸药为使。该方并突出体现了中医“异病同治”的治疗特点，临床应用取得了较好的疗效。

本实验结果显示，甲乙煎对大鼠肝组织炎症程度和纤维化程度均有显著改善作用，但没有观察到它对MMP-2的影响作用，有可能甲乙煎并非是通过下调MMP-2来抑制肝纤维化的，我们需要进一步研究。高剂量的甲乙煎能明显控制实验性肝纤维大鼠的肝组织炎症和抑制其纤维化程度，低剂量的甲乙煎能明显控制实验性肝纤维大鼠的肝组织炎症，但抑制纤维化程度方面较高剂量差。甲乙煎从调脾入手，健脾利湿﹑理气和胃﹑疏肝解郁，为中医药防治肝炎和防治肝纤维化开拓了新思路。

[1] 王卫华. 甲乙煎对肝纤维化大鼠肝细胞转化生长因子β1蛋白水平的影响[J].中西医结合肝病杂志,2016，26 (3):171-172.

[2] 王泰龄,刘霞,周元平,等.慢性肝炎炎症活动度及纤维化程度计分方案[J].中华肝脏病杂志,1998,6(4):195-197.

[3] Iwaisakok, BrennerDA,KisseLevaT.What’s new in Live fibrosis? The origin of myofibroblasts in liver fibrosis [J].J Gasttroenterol Hepatol,2012，27(Suppl2)：65-68.

[4] Wojtowicz-PragaSM,Dickson RB,Hawkins MJ,etal.Matrix metalloprotein-aseinhibitors[J]. Invest New Drugs,1997,15(1):61-75.

ThestudyofJiayijianontheExpressionofRatswithHepaticFibrosis

WANGWei-hua

Division5thofLiverDiseases,HospitalforInfectiousDiseasesofHandan(HandanHebei, 056002)China

2016-11-03 编辑：黄育华)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.016

邯郸市科学技术研究与发展项目(No：0923108133)