反相液相色谱质谱法使用甲酸甲胺改善甘油三酯电喷雾离子化检测灵敏度

赵海燕+龚灿+许旭

摘要提出使用甲酸甲胺作为新型电离增强剂改善反相液相色谱电喷雾质谱（LCESIMS）检测甘油三酯灵敏度的方法。使用反相C18色谱柱，以玉米油的异丙醇溶液为样品，选择文献中常用的异丙醇乙腈甲醇水，异丙醇乙腈流动相，在考察甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、甲酸丁胺、甲酸二丁胺、甲酸三乙胺、甲酸二乙胺、甲酸甲胺、甲酸乙胺等不同电离增强剂的基础上，比较了甲酸甲胺和常用的甲酸铵电离增强剂对LCESIMS分析甘油三酯检测灵敏度的影响，结果表明，甲酸甲胺可以使其中三亚油酸甘油酯组分的质谱峰响应值和信噪比均约为使用甲酸铵的5倍。考察了使用甲酸甲胺时，甲酸甲胺电离增强剂的浓度、流动相流速以及雾化气流速对检测的影响。通过测定不同玉米油浓度与其中甘油三酯总离子流色谱峰面积的关系曲线，显示玉米油中甘油三酯组分在不同流动相的电喷雾过程中出现聚集的最小浓度相差不大，三亚油酸甘油酯峰面积与浓度在7×10

Symbolm@@ 7～2×10

Symbolm@@ 4 mol/L范围内的线性关系较好，相关系数R2=0.9997，在更高的浓度时则峰面积增加缓慢。根据实验数据分析甲酸甲胺改进检测的机理，提出含有疏水性基团的加合甲胺单电荷离子具有较低的溶剂化能，在雾滴表面富集的加合甲胺离子容易被蒸发，从而提高了电喷雾离子化效率。本方法为LCESIMS分析食用油中甘油三酯时提高检测灵敏度提供了有效途径。

关键词液相色谱质谱联用； 甘油三酯； 灵敏度； 甲酸甲胺

1引 言

食用油的组成主要为各种物理化学性质相似的甘油三酯类化合物（TAGs），对其中TAGs组成的分析是食用油识别与掺假分析的重要依据。不同TAGs的分离分析常用液相色谱质谱联用（LCMS）方法，其中电喷雾离子化（ESI）方法使用较多[1，2]。但该方法存在如下问题：在低浓度样品检测时灵敏度较低，而在高浓度样品分析时脂类组成由于疏水性易出现聚集[2]，导致分析线性范围较窄。因此，提高质谱分析灵敏度，拓展酯类化合物质谱分析的线性范围对于食用油特定组成的分析具有重要意义。

改进ESI响应通常需要提高样品的离子化效率。Ikeda等[3] 用反相LCESIMS/MS分析甘油三酯时，使用乙腈/甲醇/水与异丙醇（均加入乙酸氨水缓冲液）梯度洗脱，利用串联的MS/MS获得了准确识别。Niu等[4]研究了电喷雾电离的雾化条件对检测的影响，通过比较甲酸与pH值对组分响应的影响，显示甲酸对离子化具有明显改进作用，而pH值则没有这样的效果。Segall等[5]在分析咖啡中的甘油三酯时也使用甲酸来提高离子化效率。Zeb等[6]在流动相中同时加入乙酸、乙酸铵和乙酸钠，利用不同的加和离子（[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+）来识别甘油三酯组分。目前常用的电离增强剂是甲酸、甲酸铵、乙酸、乙酸铵。Tarvainen等[7]还用锂离子作为电离增强剂，以LCESIMS分析氧化、水解和模拟消化的菜籽油样品中环氧、过氧、羟基脂肪酸和酰基甘油等组分。Mirabaud等[8]也采用锂离子作为电离增强剂来分析甘油三酯。Cech等[9]在系统综述ESIMS 研究结果的基础上，认为待测析组分易于带电荷及其适当的疏水性有助于提高ESI的响应值。这为寻找不同的电离增强剂来改善电喷雾离子化质谱检测效果提供了思路。Grossman等[10]合成了甲酸甲胺（Methylammonium formate， MAF）并利用其较低的粘度在反相液相色谱中替代甲醇，实验研究了MAF作为主要流动相改性剂的色谱性能，显示MAFH2O流动相表现出比甲醇水流动相对硝基呋喃药物更好的分离和柱效，并提出其适用于适当流速的APCI和ESI模式的LCMS系統。显示甲胺或者胺类化合物可用于LCMS体系用于改善检测检测灵敏度的研究。

本实验使用反相LCESIMS法，选择文献中常用的异丙醇乙腈甲醇水和异丙醇乙腈为反相液相色谱流动相分离甘油三酯，以玉米油异丙醇溶液为样品，提出用甲酸甲胺作为新型电离增强剂，有助于增强甘油三酯的离子化效率，提高质谱检测灵敏度，并考察了玉米油中甘油三酯组分在ESI过程中出现聚集的最小浓度[2]。本研究为LCMS分析食用油中甘油三酯时提高检测灵敏度提供了新思路。

2实验部分

2.1仪器与试剂

LCMS2020型超高效液相色谱质谱联用仪（日本岛津公司）； N341M型氮气发生器（美国Proton Energy Systems Inc公司）； SY7200D型超声波清洗机（上海声源超声仪器设备有限公司）； XS105 Dual Range型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

乙腈、异丙醇、甲醇（HPLC级， 上海阿达玛斯公司）； 丁胺、二丁胺、三乙胺、二乙胺、甲胺（25%～30%）、乙胺（65%～70%）为国产分析纯试剂。甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵（HPLC级，上海安谱实验科技股份有限公司）； 三油酸甘油酯（纯度99%，阿拉丁试剂（上海）有限公司）。实验用水为某品牌蒸馏水。食用油样品为某品牌非转基因压榨玉米油（购自本地超市）。

2.2实验方法

2.2.1样品及其准备分别移取玉米油样品1，5和10 μL 溶于1000 μL 异丙醇， 配制浓度为1～10 μL/mL的样品溶液。

2.2.2LCMS实验条件（1）色谱条件Ultimate UHPLC XBC18色谱柱（150 mm × 2.1 mm × 1.8 μm， 月旭科技（上海）股份有限公司）。分别使用流动相（1）：异丙醇乙腈甲醇水（80∶81.6∶14∶0.4， V/V）和流动相（2）：异丙醇乙腈（50∶50， V/V）两种流动相，并分别在其中加入5 mmol/L甲酸铵（A）和5 mmol/L甲酸 + 5 mmol/L 甲胺（B）两种电离增强剂，以1A、1B、2A、2B 4种流动相的等度洗脱方式分离分析。流速为0.3 mL/min，进样量为3 μL。直接进样的ESIMS分析时，将上述色谱条件中的色谱柱用两通代替。（2）质谱条件ESI 电离源，正离子电离模式，质荷比范围m/z 300～1200，雾化气流速1.5 L/min，干燥气流速15 L/min，DL 温度250℃，检测器电压1.05 kV。endprint

3结果与讨论

3.1电离增强剂的选择

选择文献中常用的异丙醇乙腈甲醇水[3]和异丙醇乙腈[5，11～13]为流动相，比较了使用甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、甲酸丁胺、甲酸二丁胺、甲酸三乙胺、甲酸二乙胺、甲酸甲胺、甲酸乙胺不同的电离增强剂对检测灵敏度的影响。其中，甲酸与甲酸铵、乙酸与乙酸铵均差异不大，而在相同的胺浓度时，比较使用甲酸丁胺、甲酸二丁胺、甲酸三乙胺、甲酸二乙胺、甲酸甲胺、甲酸乙胺的选择离子检测（SIM，均选择丰度最大的[三油酸甘油酯+胺]+），结果显示，甲酸甲胺的信噪比最高，其次是甲酸乙胺，见图1。

分别考察不同浓度的甲酸甲胺和甲酸乙胺作为电离增强剂， ESI直接进样测定玉米油样品中三油酸甘油酯的离子峰强度的差异，分别见表1和表2。除个别情况外，在相近的胺浓度条件下，使用甲酸甲胺时三油酸甘油酯的离子峰强度明显高于甲酸乙胺时三油酸甘油酯的离子峰强度。因此，后续的LCMS实验主要将甲酸甲胺与常用的甲酸铵进行比较。

3.2甲酸甲胺和甲酸铵电离增强剂对不同流动相LCMS灵敏度的影响

以玉米油为样品，系统地比较了甲酸铵和甲酸甲胺这两种电离增强剂对反相LCESIMS分析食用油中甘油三酯检测灵敏度的影响。

分别以异丙醇乙腈甲醇水（80∶81.6∶14∶0.4， V/V）、異丙醇乙腈（50∶50， V/V）为流动相，分别添加5 mmol/L甲酸铵和甲酸甲胺，比较色谱行为。由于加入的是甲胺水溶液，为了保持检测环境一致，在甲酸铵中加入相应量的水（0.1%，V/V）。在此4种条件下，在25 min内均可实现对玉米油中甘油三酯的分析。玉米油浓度为0.5 μL/mL时LCMS分析的TIC谱图如图2所示。

a：异丙醇乙腈（50∶ 50， V/V）加入5 mmol/L甲酸 + 5 mmol/L 甲胺 （流动相2B）； b： 异丙醇乙腈（50∶ 50， V/V）加入5 mmol/L甲酸铵 （流动相2A）； c：异丙醇乙腈甲醇水 （80∶ 81.6∶ 14∶ 0.4， V/V） 加入5 mmol/L甲酸 + 5 mmol/L 甲胺 （流动相1B）； d：异丙醇乙腈甲醇水 （80∶ 81.6∶ 14∶ 0.4， V/V） 加入5 mmol/L甲酸铵 （流动相1A）

a： isopropanolacetonitril （50∶50， V/V） containing 5 mmol/L formic acid and 5 mmol/L methylamine （mobile phase 2B）； b： isopropanolacetonitril （50∶ 50， V/V） containing 5 mmol/L ammonium formate （mobile phase 2A）； c： isopropanolacetonitrilmethanolwater （80∶ 81.6∶ 14∶ 0.4， V/V） containing 5 mmol/L formic acid and 5 mmol/L methylamine （mobile phase 1B）； d： isopropanolacetonitrilmethanolwater （80∶ 81.6∶ 14∶ 0.4， V/V） containing 5 mmol/L ammonium formate （mobile phase 1A）

实验中使用单根C18超效柱，玉米油中的甘油三酯以组分的碳当量不同分离为4组峰。根据各峰的质谱图可以看到，当流动相中使用甲酸铵时，甘油三酯在ESI+模式下产生[M+NH4]+、[M+H]+和[M+H-RCOOH]+离子，以[M+NH4]+为基峰； 而使用甲酸甲胺时，甘油三酯在ESI正离子模式下只产生[M+CH3NH3]+离子。从质谱图还可以推测，峰1、2、3、4四组峰的碳当量数分别为42、44、46、48，峰1主要为LLL，峰2可能包括OLL/LOL/OLnO/PLL，峰3可能包括OOL/POL/PLO/OPL/PPL，峰4可能包括OOO/OSL/OLS/SLnS/PPO。

从图2可见，使用甲酸甲胺时组分的峰高明显高于使用甲酸铵时的峰高，且不影响组分的分离。比较不同浓度玉米油的信噪比，峰1（LLL）在使用甲酸铵流动相（b）时，检测响应[M+NH4]+ 的峰高为925621，信噪比约27.1（SIM模式m/z 896.8信噪比为231.9）。而以甲酸甲胺为流动相（a）时，峰1的检测响应[M+CH3NH3]+为4652190，信噪比达到138.5（SIM模式m/z 910.8信噪比为1340.5），即相同样品浓度下，峰1使用甲酸甲胺流动相得到[M+CH3NH3]+峰的响应值约是使用甲酸铵流动相得到[M+NH4]+峰响应值的5倍，信噪比也提高约5倍，显示使用甲酸甲胺作为检测甘油三酯的电离增强剂时灵敏度得到明显改善。也提示甲酸甲胺流动相在降低噪音时的潜力。

分别分析9种不同浓度的玉米油样品，对图2中部分大峰积分后，考察TIC峰面积与玉米油浓度的关系见图3，低浓度时呈较好的线性关系，但浓度增加到特定值后，峰面积对浓度的响应曲线向下偏离线性。玉米油浓度1 μL/mL为转折点，在此浓度以下，线性相关系数分别为0.9940、0.9997、0.9976、0.9997和0.9982，超过此浓度则LCMS峰面积增加不多，显示其已经达到电

3.3使用甲酸甲胺电离增强剂时LCESIMS实验条件的影响

3.3.1甲酸甲胺电离增强剂浓度的影响

以异丙醇乙腈（50∶50，V/V）为流动相，分别加入0.43～31.0 mmol/L甲酸甲胺。选取0.5 μL/mL玉米油异丙醇溶液为分析样品，LCMS实验结果表明，在实验浓度范围内，甲酸甲胺浓度对峰面积值影响不大，信噪比波动不大。endprint

3.3.2流动相流速的影响在甲酸甲胺浓度3 mmol/L条件下，考察了0.15～0.40 mL/min 流速下峰面积（如图4所示）和信噪比的变化，结果表明，随着流速降低，峰响应也随之升高，信噪比也缓慢升高。通常认为低流速下产生细雾滴，有利于产生气相离子，提高信号强度。

3.3.3雾化气流速的影响当甲酸甲胺浓度为3 mmol/L时，从分析时间考虑，选择流速0.3 mL/min，考察了雾化气（N2）流速（0.5、0.8、1.0、1.3和1.5 L/min）对峰面积（如图5所示）和信噪比的影响。结果表明，随着雾化气流速升高，峰面积和信噪比也随之升高，即雾化气流速为1.5 L/min（仪器设定的最高流速）最优。

3.4线性范围

选择流动相异丙醇乙腈（50∶50，V/V，甲酸甲胺浓度为3 mmol/L），流速为0.3 mL/min，雾化气1.5 L/min。分析浓度为0.1 μL/mL的玉米油样品，其TIC图如图6A所示，选择SIM模式测定m/z 910.8三亚油酸甘油酯（LLL）的谱图见图6B。比较图6B与图6A相应的峰，半峰宽相差不大，考慮玉米油的脂肪酸组成，可以认为峰1主要为LLL。按其信噪比为306.8，面积比18.8%，估算检出限约为2×10

Symbolm@@ 7 mol/L。通过选择SIM模式测定LLL的峰面积与浓度的比较，如图7所示，线性范围约为7×10

Symbolm@@ 7～2×10

Symbolm@@ 4 mol/L。

3.5甲酸甲胺改进ESI检测的机理

实验表明，流动相中加入甲酸甲胺时，被测化合物产生[M+CH3NH3]+峰的信号强度明显高于其在用甲酸铵流动相时产生的[M+NH4]+峰的信号强度，如图8所示。根据实验中仅使用甲酸铵流动相时才产生甘油二酯碎片离子，推测组分分子加合铵离子比加合含有疏水性基团的甲胺单电荷离子具有更高的溶剂化能，在雾滴表面富集的加合甲胺离子更容易被蒸发，而NH+4相对较高的溶剂化能，可能使CO键断裂产生甘油二酯碎片离子； 另一方面，根据相同实验条件下同一组分离子蒸发速率比（k[M+CH3NH3]+/k[M+NH4]+）等于该组分在两种流动相条件下得到的TIC峰强度比（I[M+CH3NH3]+/I[M+NH4]+）[14]，利用3.2节峰高比的结果可以得到，三亚油酸甘油三酯（LLL）组分在分别含两种电离增强剂流动相的ESI过程中，离子蒸发速率比≈5。这也证实含有疏水性基团的加合甲胺单电荷离子具有较低的溶剂化能，在雾滴表面富集的加合甲胺离子容易被蒸发，提高了ESI离子化效率，从而提高了质谱检测灵敏度。

3.6有机胺残留问题的实验处理

实验中，除甲胺外，其它有机胺类电离增强剂都存在不同程度的残留，很容易影响实验结果。根据经验，可以利用反相HPLC柱中的胺在酸性条件下容易洗去，而质谱中游离胺容易挥发的特点，用下面的方法冲洗流路、解决残留问题：首先移开质谱流路，使用含有0.3%甲酸的异丙醇溶液冲洗柱子1 h，待紫外检测器210 nm波长检测的基线平稳后，将HPLC柱换成两通，再接上质谱流路，用含有0.3%氨水的异丙醇溶液冲洗1 h，流速为0.3 mL/min。另外，可以在使用含胺缓冲液时仅用一根流路管道，或者更换含胺流动相连接脱气机的管路，避免该管路可能存在的吸附问题。

4结 论

LCMS或LCMS/MS是微量成分测定的重要方法，但较低的电离效率是困扰许多样品分析的问题。本研究提出用甲酸甲胺作为电离增强剂，用于反相LCESIMS分析时可以改善甘油三酯检测的灵敏度。相同样品浓度下，三亚油酸甘油酯（LLL）组分使用甲酸甲胺流动相得到[M+CH3NH3]+峰的TIC响应值约是使用通常的甲酸铵流动相得到[M+NH4]+峰响应值的5倍，信噪比也提高约5倍。不同流动相中甘油三酯出现聚集的最小浓度[2]约为0.1～0.3 μL/mL。在选定的实验条件下，检出限约为2×10

Symbolm@@ 7 mol/L。本研究为LCMS分析食用油中甘油三酯时提高检测灵敏度提供了新思路。

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Improvement of Detection Sensitivity of Triglyceride with Methylamine

Formate as Ionization Enhancer in Reversed Phase Liquid

ChromatographyElectrospray Ionization Mass Spectrometry

ZHAO HaiYan， GONG Can， XU Xu*

（School of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）

AbstractA novel ionization enhancer， methylamine formate， was proposed for improving the detection sensitivity of triglyceride in edible oil by reversed phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry （LCESIMS）. The commonly used isopropanolacetonitrilemethanolwater and isopropanolacetonitrile were selected as the mobile phase. By using a reversed phase C18 column， and taking the corn oil in isopropyl alcohol as sample solution， we compared methylamine formate with ammonium formate， as ionization enhancers， for their effect on the detection sensitivity of triglyceride by LCESIMS after screening other different ionization enhancers， such as formic acid， acetic acid， ammonium formate， ammonium acetate， butyl formate， dibutylamine formate， triethylamine formate， diethylamine formate， methylamine formate， and ethylamine formate. The result indicated that， by using methylamine formate， the mass spectral peak response and the signal to noise ratio for trilinoleic glyceride component were 5 times higher than that of ammonium formate. The effect of the concentration of methylamine formate ionization enhancer， the flow rate of the mobile phase and the flow rate of nebulizing gas on the detection of methylamine formate were investigated. The concentration of triglyceride components in corn oil starting to form aggregates was similar in different mobile phases in the electrospray process according to measurement of the relationship between corn oil concentrations and the total ion chromatogram peak area of triglyceride. In particular， the peak area of trilinolein was linear with its concentration in the range of 7×10

Symbolm@@ 7-2×10

Symbolm@@ 4 mol/L （R2=0.9997）， but increased slower in the higher concentration range. According to the experimental data， the mechanism for improvement of detection sensitivity of methylamine formate was suggested as that the addition of methylamine monocharged ions with hydrophobic groups had lower solvation energy， which made the enriched addition ions easily evaporation from the droplet surface， thus improving the electrospray ionization efficiency. This method provided an effective way to improve the detection sensitivity of triglyceride in edible oil by LCESIMS.

KeywordsLiquid chromatographymass spectrometry； Triglyceride； Sensitivity； Methylamine formate

（Received 5 April 2017； accepted 30 May 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 31671928） and the Natural Science Foundation of Shanghai， China （No. 15ZR1440800）endprint