竞争法免疫层析试条的数学模型与仿真研究
2017-10-16曾念寅朱盼盼李玉榕姜海燕杜民
曾念寅 朱盼盼 李玉榕 姜海燕 杜民
摘要根据竞争法免疫层析试条的检测原理，本研究将其分为TwA和TnA两种模式，结合对流扩散方程分别建立其数学模型，并运用COMSOL软件对试条的动态反应过程进行仿真，得到检测线和质控线上各复合物浓度关于各影响因素的关系曲线。在TwA模式中，分析了待测物浓度[A0]=0～20 mol/L，标记物浓度[P0]=0.01～100 mol/L，检测线位于5～20 mm位置等因素对于检测结果的影响；在TnA模式中，分析了[A0]= 0～20 mol/L， [P0]=0.01～100 mol/L， [A0]和[P0]两种物质浓度及孔隙率等因素对于检测结果的影响。结果表明，本研究建立的竞争法模型与仿真能探究各参数对于检测结果的影响，优化试条性能，从而提高试条检测灵敏度和实现定量检测。
关键词免疫层析试条； 竞争法； 对流扩散； 数学模型； 生化反应过程
1引 言
随着免疫层析层析技术的不断发展和“床边检测”的兴起，免疫层析试条被广泛用于快速检测与疾病的评估[1～3]。 为了提高其检测性能和扩大应用领域， 研究人员做了许多工作[4～16]。 很多研究者根据免疫层析试条反应机理建立数学模型，辅助优化设计免疫层析定量检测试条[8～12]。
在免疫层析试条建模的研究中，本研究组曾利用控制理论建立了免疫层析生化反应过程的非线性状态空间方程模型，通过该模型能够便捷地预测试条的性能，并实现动态定量测定[8～10]。Qian等[11，12]根据夹心法和竞争法原理分别初步建立了免疫层析反应过程数学模型。2017年，本研究组基于夹心法免疫层析试条检测原理，通过COMSOL对建立的夹心法数学模型进行仿真，分析得到了各因素对试条性能的影响[16]。在前期工作的基础上，结合Qian等[12]的研究成果， 本研究建立了竞争法免疫层析试条的生化反应的数学模型，并通过COMSOL软件对试条动态反应过程进行仿真。依据检测线上的生成物是否含有待测物将竞争法分为TwA模式和TnA模式两种，通过建立的模型能够辅助设计并优化试条，从而提高试条检测灵敏度和实现定量检测。
2竞争法免疫层析试条的数学模型
根据竞争法免疫层析试条中待测物是否会结合检测线上的抗体/抗原，即检测线上的生成物是否含有待测物，将竞争法分为两种模式：（1） 检测线上生成物含待测物模式，即TwA模式；（2） 检测线上生成物不含待测物模式，即TnA模式。
2.1TwA模式竞争法的数学模型
如图1所示，待测物A （若存在） 与标记物P不发生反应。当包含有A和P的混合液移动到检测线时，A与P会与检测线上的RT竞争地发生结合反应，分别形成RTA和RTP。同时，假设RT和A反应产生RTA，它将不能再依附于P，反应式如下：
A+RTka1kd1RTA（1）
P+RTka2kd2RTP（2）
因此，A、P、RTA和RTP可以由以下对流扩散反应方程式描述[12，16]：
DA2[A]x-U[A]x-[A]t=ka1[A]（[RT0]-[RTA]-[RTP]-kd1[RTA]）（3）
DP2[P]x2-U[P]x-[P]t=ka2[P]（[RT0]-[RTA]-[RTP]-kd2[RTP]）（4）
[RTA]t=ka1[A]（[RT0]-[RTA]-[RTP]）-kd1[RTA]）（5）
[RTP]t=ka2[P]（[RT0]-[RTA]-[RTP]）-kd2[RTP]）（6）
混合液在通過检测线之后继续移动，当流经质控线时P与质控线上包被着的RC反应形成RCP：
P+RCka3kd3RCP（7）
在质控线上的P和RCP分别由以下对流扩散反应方程式描述[12，16]：
DP2[P]x2-U[P]x-[P]t=ka3[P]（[RC0]-[RCP]-kd3[RCP]）（8）
[RCP]t=ka3[P]（[RC0]-[RCP]-[RCP]）-kd3[RCP]）（9）
2.2TnA模式竞争法的数学模型
如图2所示，由于在混合液进入硝酸纤维膜之前P和A被预先混合，A （若存在） 将结合P形成PA，而PA不能结合检测线RT。只有自由的P可以与RT结合：
P+Aka1kd1PA（10）
P+RTka2kd2RTP（11）
P，RTP分别由以下对流扩散反应方程式描述[12，16]：
DP2[P]x2-U[P]x-[P]t=ka2[P]（[RT0]-[RTP]）-kd2[RTP]（12）
[RTP]t=ka2[P]（[RT0]-[RTP]）-kd2[RTP]）（13）
在质控线上，PA和自由的P都可以在质控线处与RC结合：
PA+RCka3kd3RCPA（14）
P+RCka4kd4RCP（15）
P，PA，RCP，RCPA分别由以下对流扩散反应方程式描述[12，16]：
DP2[P]x2-U[P]x-[P]t=ka4[P]（[RC0]-[RCPA]-kd4[RCP]）（16）
DP2[PA]x2-U[PA]x-[PA]t=ka3[PA]（[RC0]-[RCPA]-[RCP]-kd3[RCPA]）（17）
[RCP]t=ka4[P]（[RC0]-[RCPA]）-kd4[RCP]）（18）
[RCPA]t=ka3[PA]（[RC0]-[RCPA]-[RCP]）-kd3[RCPA]）（19）
3数学模型的约束条件与环境设置
竞争法免疫层析试条中各物质的生化反应过程同夹心法原理[16]一样，在符合上述建立的数学模型外，还需满足质量守恒定律并遵循动量守恒定律，具体描述见文献[16]中的公式（12）和（13）。endprint
TwA模式在COMSOL的仿真中初始条件设置如下：
[A]（x，0）=[P]（x，0）=[RTP]（x，0）=[RCP]（x，0）=0（20）
[RT]（x，0）=R0[]xL1≤x≤xL2
0[]x
[RC]（x，0）=R0[]xL3≤x≤xL4
0[]x
在试条的入口 （x = 0） 处有：
[A]（0，t）=[A0]×f1t（23）
[P]（0，t）=[P0]×f1t（24）
其中， f1t是一个分段函数，在0～20s时等于1，其余为0。
在试条的出口 （x = L） 处有：
[A]（L，t）x=[P]（L，t）x=0（25）
[RT]（L，t）=[RT]（L，t）=[RTA]（L，t）=[RTP]（L，t）=[RCP]（L，t）（26）
TnA模式在COMSOL的仿真中初始条件设置如下：
[A]（x，0）=[P]（x，0）=[PA]（x，0）=[RTP]（x，0）=[RCP]（x，0）=[RCPA]（x，0）=0（27）
[RT]（x，0）=R0[]xL1≤x≤xL2
0[]x
[RC]（x，0）=R0[]xL3≤x≤xL4
0[]x
在试条的入口 （x=0） 处的物质浓度如式 （23） （24） 所示，在试条的出口 （x = L） 处有：
[RT]（L，t）=[RC]（L，t）=[RTP]（L，t）=[RCP]（L，t）=[RCPA]（L，t）（30）
4仿真结果与讨论
为了验证建立的竞争法免疫层析试条数学模型，运用COMSOL软件进行仿真，其参数设置为： ka1=ka2=ka3=ka4=10
Symbolm@@ 3 L/（mol·s）， kd1=kd2=kd3=kd4=10
Symbolm@@ 3 （s
Symbolm@@ 1）， [A0]=10 mol/L， [P0]=10 mol/L， [RT]=10 mol/L， [RC]=10 mol/L， L=0.00041 m， U=2×10
Symbolm@@ 4 m/s。
4.1TwA模式中，待测目标分析物[A0]对检测线和质控线复合物的影响与分析
首先通过改变[A0]来分析其对检测线和质控线上复合物的影响，并在试条的整个动态反应过程中其他物质都足够量，结果如图3所示。
从图3可见，当[A0]逐渐增加时，[RTA]随之逐渐增多，而[RTP]随之逐渐减少，但[RTP]和[RTA]的總和基本不变；另外，[A0]的增加对质控线的[RCP]几乎没有影响。这是因为在TwA模式中，只是A和P竞争RT，所以[A0]的增加只会影响检测线的免疫反应。
4.2TwA模式中，标记物[P0]对检测线和质控线复合物的影响与分析
保持[A0]不变，检测线和质控线上生成的复合物随着[P0]的改变而变化的情况如图4所示，只有当[P0]浓度大于一定值时，检测线上的生成的[RTP]开始增大，而由于RT的原因[RTA]相应地减小，且[RCP]基本保持不变。
4.3TwA模式中，检测线位置对于检测线上生成复合物的影响与分析
[A0]改变时，检测线上生成 [RTP]随检测线位置变化的情况如图5所示，当[A0]较低时，检测线位置对于检测结果没有太大影响。[A0]增大时，在质控线位置不变的情况下，检测线位置的变化，会对检测结果有一定的影响。因此， 检测线的位置选取是试条具有较好的定量检测效果的一个关键因素。
4.4TnA模式中，待测目标分析物[A0]对检测线和质控线复合物的影响与分析
[A0]的浓度变化时对检测线和质控线复合物的影响如图6所示，随着A0的增加，检测线上生成的[RTP]会随着减少。在[A0]比较小时，[A0]对[RTP]的影响较小，[RTP]几乎不随着[A0]的变化而变化。当[A0]增加到某一值后，[RTP]会随着[A0]的增加减少比较快，这可能是与标记物浓度和检测线上的物质浓度有关。另外，质控线上的生成物[RCP]随着[A0]的增加而减少，[RCPA]随着[A0]的增加而增加。
4.5TnA模式中，标记物[P0]对检测线和质控线复合物的影响与分析
改变标记物P0的浓度对检测线和质控线上生成的复合物浓度的影响如图7所示，当[P0]较小时，检测线上RTP浓度几乎为0，而质控线上的反应有RCPA的生成， 这也说明在混合液进入质控线以前有PA产生。当[P0] = 1～10 mol/L时，检测线上开始生成[RTP]；当[P0]>10 mol/L时，检测线上[RTP]的生成量增加，质控线上生成物RCPA减少。[RCPA]下降可能是由于质控线上[RC]的量有限导致，质控线上所产生复合物[RCPA]和[RCP]的总和保持不变。
TP]生成，说明试条中预先滴入的标记物都与待测物结合而以复合物的形式呈现（从[RCPA]的改变情况可以看出），而检测线的RT无法结合复合物状态的P，故而在检测线上没有RTP出现。在[P0]>8 mol/L时，由于待测物所含的A结合P的能力有限，因此有多余P以单体的形式存在，在流经检测线时与RT结合而生成RTP。在[P0]>12 mol/L时，检测线上生成的[RTP]的量不随[P0]浓度的变化而变化，这可能是由于检测线上RT的结合能力有限， 无法结合更多的P生成RTP，或者是由于受混合液流速的影响， RT与单体标记物P的结合时间有限，来不及结合生成更多的RTP。
4.6TnA模式中， [A0]和[P0]对检测线和质控线复合物的影响与分析
通过同时改变A0和P0的浓度分析其对检测结果的影响，结果如图9所示，[A0]与[P0]的相对浓度不仅会影响到定量检测结果，而且还将影响免疫层析试条的定性以及半定量检测结果。
4.7硝酸纤维素膜上的孔隙率对试条反应的影响
进一步考虑到试条硝酸纤维素膜上的孔隙率对竞争法免疫层析试条的影响，其中，孔隙率对流过试条中混合液的流速的影响如图10所示。 假设质控线上含显色标记物的信号强度为SC，其表达式为SC=[RCP]+[RCPA]。 图11是孔隙率对质控线信号强度的影响。 从图10和图11可见，孔隙率对流速有影响；而对质控线上含显色标记物的信号强度有影响但影响不大。
5結 论
本研究建立了竞争法免疫层析试条动态反应过程的数学模型，并利用COMSOL软件对建立的模型进行仿真。基于检测原理将竞争法免疫层析分为TwA和TnA两种模式。在TwA模式中：（1） 待测物浓度的增加只会影响检测线的免疫反应，而且检测线生成的标记复合物浓度与待测物浓度呈负相关；但在整个反应生成过程中包含待测物的复合物浓度与待测物浓度呈正相关。（2） 结合释放垫上的标记物浓度较小时，检测线上几乎没有标记复合物生成，当其达到一定值后，标记复合物浓度与标记物浓度呈正相关。（3） 检测线位置的选取是免疫层析试条准确反映定量检测结果的一个很关键因素。在TnA模式中： （1） 待测物浓度的增加会同时影响检测线和质控线的免疫反应，且检测线生成的标记复合物浓度与待测物浓度呈负相关。（2） 标记物P的浓度应该大于一定值后，检测线上生成的标记复合物浓度才能准确反应待测物的浓度；且标记物P的浓度大于一定浓度后对检测的效果影响不大。
另外，相比于TnA模式竞争法，TwA模式对待测物浓度的变化更灵敏且检测效果好。孔隙率对流速有影响，而对质控线上含显色标记物的信号强度的影响并不大。
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16ZENG NianYin， ZHU PanPan， LI YuRong， JIANG HaiYan， CHU LuTao， DU Min.Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（1）：69-74
曾念寅， 朱盼盼， 李玉榕， 姜海燕， 褚蘆涛， 杜 民. 分析化学， 2017， 45（1）： 69-74
Study on Mathematical Model and Simulation of
Competitiontype Lateral Flow Immunoassay
ZENG NianYin*1， ZHU PanPan1， LI YuRong2， JIANG HaiYan2， DU Min2
1（Department of Instrumental and Electrical Engineering， Xiamen University， Xiamen 361005， China）
2（Fujian Key Laboratory of Medical Instrumentation and Pharmaceutical Technology，
Fuzhou University， Fuzhou 350116， China）
AbstractA mathematical model of competitiontype lateral flow immunoassay （LFIA） was developed to describe the dynamic process of LFIA. The competitiontype LFIA was divided into two categories： TwAcompetitiontype LFIA and TnAcompetitiontype LFIA. On the basis of the developed model， the COMSOL software was exploited to simulate the dynamic process of LFIA. The simulation result demonstrated the relationships between the concentrations of substances on the test and control lines and the influence factors. In particular， the influence factors in the TwAcompetitiontype LFIA included the concentrations of target analyte A （0-20 mol/L） and reporter particle P （0.01-100 mol/L）， and the position of the test line （5-20 mm）. On the other hand， the influence factors in the TnAcompetitiontype LFIA included the concentrations of target analyte A （0-20 mol/L） and reporter particle P （0.01-100 mol/L）， and the porosity. Experiment result showed that the developed model could be used to explore the influence of the parameters on the test results， and optimize the performance of LFIA.
KeywordsLateral flow immunoassay； Competitiontype； Convectiondiffusion equation； Mathematical model； Biochemical reaction process.
（Received 4 May 2017； accepted 21 July 2017）
This work was supported by the UKChina Industry Academia Partnership Programme （No.UKCIAPP/276）， the National Natural Science Foundation of China （No. 61403319）， the Natural Science Foundation of Fujian Province， China （No. 2015J05131） and the Fujian Provincial Key Laboratory of EcoIndustrial Green Technology.endprint
