响应面优化虾夷扇贝抗氧化肽酶解液工艺研究

梁晓芳，牟建楼，*，严超，宋春华，尹斯雅，刘建达

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；2.保定市产品质量监督检验所，河北保定071000；3.定州农业局，河北定州073000）

响应面优化虾夷扇贝抗氧化肽酶解液工艺研究

梁晓芳1，牟建楼1，*，严超1，宋春华1，尹斯雅2，刘建达3

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；2.保定市产品质量监督检验所，河北保定071000；3.定州农业局，河北定州073000）

为制备富含抗氧化肽的扇贝酶解液，以虾夷扇贝为原料，以水解度和DPPH自由基清除率为指标，应用响应面法优化扇贝蛋白的生物酶解工艺，并测定了富含活性肽酶解液的体外抗氧化性。结果表明：扇贝蛋白生物酶解适宜工艺参数为蛋白酶用量3.1%，酶作用温度45℃，作用时间4.5 h，此工艺参数下酶解液DPPH自由基清除率为82.06%，总抗氧化能力为0.11 U/mg prot，抗超氧阴离子活力为0.37 U/g prot，羟自由基清除率为55.31%。

虾夷扇贝；生物酶解；抗氧化性

Abstract：In order to get antioxidant peptide，the response surface experiment on enzymatic hydrolysis conditions was optimized and the in vitro antioxidant activity of the active peptide hydrolyzate was determined with the Patinopecten yessoensis as raw material and the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate as the indexs.The results showed that the appropriate amount of enzyme was 3.1%，hydrolysis temperature was 45℃，enzymolysis time was 4.5 h.The DPPH radical scavenging rate was 82.06%under the process parameters.And the total antioxidant capacity of the enzymatic hydrolysateof Patinopecten yessoensis was 0.11 U/mg prot，the anti superoxide anion activity was 0.37 U/g prot，the scavenging rate of hydroxyl radical was 55.31%.

Key words：Patinopecten yessoensis；enzymatic hydrolysis；antioxidant

扇贝是我国沿海地区的主要养殖物种，其年产量可达到我国总养殖量的81.59%[1]。扇贝富含蛋白质、不饱和脂肪酸、微量元素和B族维生素等。经常食用贝类食品可以有效地预防心脏病、中风以及老年痴呆症[2-7]。虾夷扇贝主要分布在俄罗斯、日本及朝鲜北部海域等[8]，是世界上最重要的经济养殖贝类之一。

利用生物酶解法处理扇贝，所得酶解液具有多种优点，一方面其营养价值高，便于储存和运输，另一方面富含活性肽。活性肽的研究日益成为现代海洋动物研究的重点，它可以有效地清除自由基，动物及病理模型实验也已经证明了多肽具有良好的生理活性[9-11]。另外，扇贝蛋白酶解后会表现出良好的溶解性，较强的乳化性和较好的流动性。因此，扇贝多肽可以作为天然的抗氧化剂在药品、日用品、食品工业等方面进行开发和利用[12]。

目前所见报道多为利用海湾扇贝和扇贝下脚料进行生物酶解、功能研究等[13-15]。本研究将对虾夷扇贝的生物酶解工艺参数进行优化，制取富含生物活性肽的酶解液，并对酶解液的抗氧化性进行研究，为后期将酶解液应用于研发具有抗氧化活性的扇贝发酵调味品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾夷扇贝：秦皇岛洪嘉食品有限公司，冷冻保存。

中性蛋白酶（＞6 000 U/mg）：北京奥博星生物技术有限公司；甲醛（分析纯）：天津市福晨化学试剂有限公司；DPPH：梯希爱化成工业发展有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒、抗超氧阴离子试剂盒（A052）：南京建成生物工程研究所。

HH-2电热恒温水浴锅：上海比朗仪器有限公司；Neofuge15R高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；JJ-2组织匀浆机：金坛市亿通电子有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 扇贝酶解工艺流程

扇贝解冻→去除内脏，清洗→绞成肉糜→称量→加水匀浆→调节pH值→酶解→100℃灭酶→4 500 r/min离心15 min→取上清液→扇贝酶解液

1.2.2 蛋白酶种类的选择

选用4种生物蛋白酶对扇贝蛋白质进行酶解，以水解度和DPPH自由基清除率为指标，各处理互为对照，试验重复3次。各种酶的处理条件见表1。

表1 不同蛋白酶的酶解条件Table 1 Hydrolysis conditions of different types of proteases

1.2.3 扇贝酶解的单因素试验

以水解度和DPPH自由基清除率为指标，在其他因素保持不变的条件下，分别考察加酶量（1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%）、酶解温度（30、35、40、45、50 ℃）、酶解时间（3.5、4、4.5、5、5.5 h）对酶解效果的影响。试验重复3次。

1.2.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上，以DPPH自由基清除率（Y）为因变量，酶解时间（X1）、酶解温度（X2）、加酶量（X3）为自变量，采用响应面法优化虾夷扇贝蛋白酶酶解参数，试验设计见表2。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 水解度的测定

总氮含量测定：采用GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定中凯氏定氮法》；氨基酸态氮（AAN）含量测定：采用GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定中甲醛值法》；水解度（DH）计算公式：

1.2.6 DPPH自由基清除率的测定

参照夏光华[16]的方法，并稍作修改。在具塞试管中先后加入1.5 mL样品，1.5 mL蒸馏水，1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀后在室温下避光反应20 min，然后倒入比色皿中在517 nm下测其吸光值记为As，空白组则用1.5 mL无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，测定其吸光值记为Ax；对照组用1.5 mL蒸馏水代替样品，测定其吸光值记为A0，并以等体积的蒸馏水空白调零，DPPH自由基清除率AOA按以下公式计算：

1.2.7 羟自由基清除率的测定

参照田倩[17]的方法，并稍作修改。向具塞试管中依次加入0.75 mmol/L邻二氮菲溶液1 mL，0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）1 mL，待测样品溶液1 mL及0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 mL，混匀后加入体积分数为0.01%的H2O2溶液1 mL摇匀，37℃水浴1 h，在536 nm波长下测定吸光度（A样）；用去离子水代替样品溶液测定损伤管吸光度（A损）；用去离子水代替样品溶液和H2O2测定未损伤管吸光度（A未损）；参照组为等体积的样品溶液、磷酸盐缓冲溶液和去离子水，测定吸光度（A参）；空白组为等体积的去离子水和磷酸盐缓冲溶液，测定其吸光度（A空）。羟自由基清除率的计算公式为：

1.2.8 总抗氧化能力测定

参照试剂盒说明书。

1.2.9 抗超氧阴离子活力的测定

参照试剂盒说明书。

1.2.10 数据处理

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类的选择

蛋白酶酶解虾夷扇贝结果如图1所示。

图1 蛋白酶种类对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of protease types on the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

由图1可知，用中性蛋白酶酶解后的水解度达到31.75%，DPPH自由基清除率为69.26%，显著高于用其他酶的酶解效果（P＜0.05）。考虑原因为中性蛋白酶为内肽酶，且水解的特异性较宽[18]，切割位点比较广[19]，所以酶解效果较好。综合考虑水解度和DPPH自由基清除率，选用中性蛋白酶对虾夷扇贝进行单因素及响应面优化酶解试验。

2.2 扇贝酶解的单因素试验

2.2.1 加酶量对扇贝酶解效果的影响

中性蛋白酶加酶量对虾夷扇贝酶解效果的影响如图2所示。

由图2可知，随着生物酶使用量的增加，虾夷扇贝的水解度呈现先增大后趋于平稳，DPPH自由基清除率先升高后降低，当加酶量为3.0%时，DPPH自由基清除率达到最大值75.20%。因为当底物浓度足够大时，酶解反应随着加酶量的增加而增加。当酶浓度增大到一定浓度时，反应体系中底物将会出现不足，酶解效率将不再上升甚至会降低。DPPH自由基清除率降低，是因为酶将蛋白质水解为活性多肽后，又将多肽水解为更短的肽链或氨基酸。所以本研究选择3.0%作为适宜加酶量。

图2 加酶量对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of enzyme addition hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

2.2.2 酶解温度对酶解效果的影响

温度对蛋白酶酶解效果的影响如图3所示。

图3 酶解温度对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of tcmpcrature on the hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

由图3可知，随着酶解温度的升高，水解度和DPPH自由基清除率均表现为先升高后降低趋势。中性蛋白酶在45℃下作用于扇贝蛋白，水解度达到最大为28.74%，酶解液DPPH自由基清除率也升高到最大值73.34%。考虑到温度升高，酶促反应速率加快，但是扇贝蛋白在温度高时会变性，而且酶本质上是蛋白质也会发生变性，所以温度过高时酶解效果会变差。因此确定45℃为扇贝生物酶解的适宜温度。

2.2.3 酶解时间对酶解效果的影响

蛋白酶酶解时间对酶解效果的影响如图4所示。

由图4可知，随着生物酶作用时间的增加，扇贝蛋白水解度先增大后趋于不变，DPPH自由基清除率先升高后降低。虾夷扇贝的水解度在4.5 h后变化不显著，DPPH自由基清除率在4.5 h时达最大值为74.07%。随作用时间的延长，酶对蛋白质逐渐进行酶解，使水解度逐渐增加，底物量逐渐减少，最后水解度几乎不变，而且多肽又被酶解成了氨基酸，所以DPPH自由基清除率升高后降低。因此本研究选择4.5 h为适宜酶解作用时间。

图4 时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

2.4 响应面试验

2.4.1 试验分析结果

中性蛋白酶酶解条件响应面试验设计及结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

利用Design expert8.0.5软件对表3中的试验数据进行分析，得拟合二次多项式方程：对回归模型进行方差分析，分析的结果见表4。

表4 回归模型显著性检验结果Table 4 Significance test for regression model

由表 4 可知，模型 F 值为 31.40，P＜0.000 1，说明该模型具有显著性，且总体上模型因素的水平项也显著。失拟项P=0.736 9＞0.05，说明未知因素对试验干扰很小，模型拟合度较好。模型的相关系数R2为0.975 8，说明方程的因变量与自变量间的线性关系显著。综合上述各参数表明该试验设计方法可靠，因素水平区间设计合理，因此可以用此回归模型模拟蛋白酶水解扇贝的DPPH自由基清除率在不同因素水平下响应值的变化。

根据回归模型的分析及检验结果，绘制响应面图（如图5～图7所示）以确定酶解时间（X1）、酶解温度（X2）、加酶量（X3）这3个因素的交互作用对DPPH自由基清除率（Y）的影响。由图可知，响应值随着酶解时间、酶解温度、加酶量的增大而呈先增后降的趋势。该响应面能够直观地反映出各因素水平对响应值的作用和影响。

图5 时间与温度对DPPH自由基清除率的影响Fig.5 Response surface of time and temperature on DPPH radical scavenging rate

图6 时间与加酶量对DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Response surface of time and enzyme addition on DPPH radical scavenging rate

图7 温度与加酶量对DPPH自由基清除率的影响Fig.7 Response surface of temperature and enzyme additionon DPPH radical scavenging rate

2.4.2 响应面结果验证

对响应面试验结果进行优化分析，以DPPH自由基清除率最大为评价指标，由回归方程得到的DPPH自由基清除率最高的组合为：X1=4.5，X2=45，X3=3.1，此时DPPH自由基清除率理论值81.60%。为验证预测模型结果的可行性，在酶解时间为4.5 h，酶解温度为45℃，加酶量为3.1%的条件下，进行中性蛋白酶酶解虾夷扇贝的试验，重复试验3次，试验结果的DPPH自由基清除率平均值为82.06%，与理论预测值的相对误差为0.56%。由此可以知道，预测模型与真实值之间有较好的拟合性，能较准确地反映中性蛋白酶酶解虾夷扇贝过程中DPPH自由基清除率的变化。

2.5 虾夷扇贝酶解液的抗氧化活性

对优化条件下得到的虾夷扇贝酶解液进行抗氧化活性测定，结果为：总抗氧化能力为0.11 U/mg prot，抗超氧阴离子活力为0.37 U/g prot，羟自由基清除率为55.31%。

3 结论

本研究对虾夷扇贝进行生物蛋白酶酶解，以扇贝蛋白水解度和酶解液DPPH自由基清除率为指标进行了酶解作用单因素试验。在单因素试验的基础上，利用响应面的方法优化了酶解时间、酶解温度、加酶量工艺参数对DPPH自由基清除率的影响。优化后的酶解条件为：加酶量为3.1%，酶解温度为45℃，酶解时间为4.5 h，此时测得酶解液DPPH自由基清除率为82.06%（与预测值的相对误差为0.56%），。总抗氧化能力为0.11 U/mg prot，抗超氧阴离子活力为0.37 U/g prot，羟自由基清除率为55.31%。这说明虾夷扇贝酶解液具有较高的抗氧化能力，为后期研发具有抗氧化活性的扇贝发酵调味品提供了理论依据。

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Optimization of Antioxidant Peptide Hydrolyzate of Patinopecten yessoensis by Response Surface Methodology

LIANG Xiao-fang1，MU Jian-lou1，*，YAN Chao1，SONG Chun-hua1，YIN Si-ya2，LIU Jian-da3
（1.College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071000，Hebei，China；2.Product Quality Supervision and Inspection Institute of Baoding，Baoding 071000，Hebei，China；3.Agricultural Bureau of Dingzhou，Dingzhou 073000，Hebei，China）

2017-03-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.017

河北省科技计划项目(14273205D)

梁晓芳（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品科学。

*通信作者：牟建楼（1973—），女（汉），副教授，研究方向：农产品加工及贮藏。