高产类胡萝卜素的蛹虫草液体培养基优化及其提取工艺研究

,俊芳,, ,,,,,*,

(1.华南农业大学食品学院&食品生物技术研究所,广东广州 510640;2.广东省微生态制剂工程技术研究中心,广东广州 510640;3.广州市澳键丰泽生物科技有限公司,广东广州 510760)

高产类胡萝卜素的蛹虫草液体培养基优化及其提取工艺研究

殷林1,2,林俊芳1,2,3,钱璟1,叶志伟1,2,罗诗华1,郭丽琼1,2,3,*,云帆3

(1.华南农业大学食品学院&食品生物技术研究所,广东广州510640;2.广东省微生态制剂工程技术研究中心,广东广州510640;3.广州市澳键丰泽生物科技有限公司,广东广州510760)

以类胡萝卜素含量为目标,采用谷物类为培养基对蛹虫草CM-03、CM-04和CM-11三株菌株进行了液体发酵培养基的优化,结果表明:三株菌株的最优培养基配方分别为CM-03:1.4 g·L-1小麦、2.8 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆、0.1 g·L-1MgSO4·7H2O、0.1 g·L-1KH2PO4、0.05 mg·L-1VB1、pH自然,类胡萝卜素含量为(694.8±15.4) μg/g;CM-04:1.2 g·L-1大米、0.6 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆,0.1 g·L-1MgSO4·7H2O、0.1 g·L-1KH2PO4、0.05 mg·L-1VB1、pH自然,类胡萝卜素含量为(708.5±25.8) μg/g;CM-11:1.7 g·L-1小麦、2.6 g·L-1玉米、0.3 g·L-1大豆,0.1 g·L-1MgSO4·7H2O、0.1 g·L-1KH2PO4、0.05 mg·L-1VB1、pH自然,类胡萝卜素含量为(700.5±19.1) μg/g。同时,使用乙醇提取法对类胡萝卜素提取工艺进行了优化,结果表明乙醇提取法的最佳工艺条件为:采用石英砂研磨破壁,乙醇浓度60%、料液比1∶40,水浴提取温度80 ℃,提取级数2级,提取率达到92.8%。

蛹虫草,类胡萝卜素,液体发酵,培养基,提取

Abstract:The cereal-based medium for liquid fermentation was optimized according to the carotenoids production of three strains ofCordycepsmilitarisCM-03,CM-04 and CM-11. The media components of this work contained several kinds of grains such as wheat(W),corn(C),bean(B),rice(R),bran(Br)and inorganic salts like MgSO4·7H2O(Mg),KH2PO4(KHP)and vitamin B1(VB1). The results showed that the best culture medium formula for the carotenoids accumulation byCordycepsmilitarisCM-03 consisted of W(1.4 g·L-1),C(2.8 g·L-1),B(0.3 g·L-1),Mg(0.1 g·L-1),KHP(0.1 g·L-1)and VB1(0.05 mg·L-1),with natural pH,with the carotenoids yield of(694.8±15.4) μg/g. ForCordycepsmilitarisCM-04,its highest carotenoids output was(708.5±25.8) μg/g under the formula consisted of R(1.2 g·L-1),C(0.6 g·L-1),B(0.3 g·L-1),Mg(0.1 g·L-1),KHP(0.1 g·L-1),VB1(0.05 mg·L-1)with natural pH. The highest carotenoids output ofCordycepsmilitarisCM-11 was(700.5±19.1) μg/g with natural pH,the formula formed by W(1.7 g·L-1),C(2.6 g·L-1),B(0.3 g·L-1),Mg(0.1 g·L-1),KHP(0.1 g·L-1)and VB1(0.05 mg·L-1). The extraction process with ethanol was also optimized in this work,and the results showed that the optimal extraction condition was as follows:grinding with quartz sand,ethanol concentration 60%,material to liquid ratio 1∶40,water bath temperature 80 ℃,extraction level 2,and extraction rate of 92.8%.

Keywords:Cordycepsmilitaris;carotenoids;liquid fermentation;medium;extraction

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草,与冬虫夏草同属异种,是一种珍贵的药用真菌。蛹虫草含有多种生物活性物质,如丰富的氨基酸、虫草素、虫草酸和虫草多糖等,在抗炎、抗肿瘤、抗衰老、提高机体免疫力上具有多种生理学功能[1],被广泛应用于食品、医疗及保健行业中。近年来,研究者发现在蛹虫草中有类胡萝卜素的存在,付鸣佳[2]首先报道了蛹虫草在光照条件下培养,其菌落呈橙黄色是由于菌丝含有高含量的类胡萝卜素。如今,类胡萝卜素已成为蛹虫草新的研究热点。

目前,已报到的蛹虫草类胡萝卜素结构的有叶黄素[3]、玉米黄素[4]和北虫草黄素[5],前两者属于脂溶性类胡萝卜素,后者具有很强的亲水性。类胡萝卜素具有抗氧化、抗癌、增强免疫力等功能,现今已发现750多种类胡萝卜素,主要存在于植物、藻类、细菌、非光营养型真菌中[6-8],其中利用杜氏盐藻生产β-胡萝卜素已成功实现工业化生产[9-11]。然而绝大部分的类胡萝卜素是脂溶性质,存在不易被人体吸收且遇热不稳定等缺点,因此提高生物利用度需要采用一些修饰方法,比如制成乳剂、纳米乳剂、混合纳米凝胶、纳米分散体、微胶囊等来应用脂溶性类胡萝卜素[12-16]。而蛹虫草中被发现含有水溶性成分的色素,与大部分脂溶性色素相比能更好地被人体吸收,生物利用度更高[5]。在蛹虫草的类胡萝卜素研究中,以谷物类作为培养基,通过液体发酵来高产类胡萝卜素还未有人尝试。本文以谷物类原料作为培养基配方,通过液体发酵的方式对三株蛹虫草产类胡萝卜素进行了培养基优化。同时,使用绿色安全的乙醇提取法对蛹虫草产类胡萝卜素的提取工艺进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛹虫草菌株CM-03、CM-04 保藏于华南农业大学食品学院生物炼制实验室;CM-11 宁阳县海鑫生物科技有限公司;谷物(大米、小麦、玉米、大豆和麸皮,粉碎过30目) 购自本地超市;果胶酶(100 U/mg) 江苏锐阳生物科技有限公司;纤维素酶(400 U/mg) 广州齐云生物技术有限公司;葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B1、琼脂粉、无水乙醇等 均为分析纯,购自成硕化学试剂公司。

SPH-2102C新颖立式小容量恒温摇床 上海世平实验设备有限公司;ME104E/02电子分析天平 广州市正一科技公司;GXZ-288B光照培养箱 宁波江南仪器制造;MJ-Ⅱ霉菌培养箱 上海一恒科技有限公司;JY92-2D超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物有限公司;UV1102紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司;FZ102粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 液体PDA培养基:200 g去皮马铃薯,20 g葡萄糖、1.0 g磷酸二氢钾、2.0 g蛋白胨和0.5 g硫酸镁,水1000 mL,pH自然,高压灭菌后备用。

基础发酵培养基:每100 mL液体中含有2 g蔗糖,0.3 g蛋白胨,0.1 g MgSO4·7H2O,0.1 g KH2PO4,0.5 mg VB1,pH自然,高压灭菌后备用。

1.2.2 菌株的活化 取菌种管或斜面保存的原种接种于PDA培养基平板上,25 ℃避光培养,待菌丝长满培养皿后放至25 ℃光照培养箱进行转色培养,得到活化的蛹虫草母种。

1.2.3 种子液的制备 从活化好的蛹虫草母种平板用小刀取2块0.5 cm×0.5 cm的菌块菌种接种于PDB液体培养基中,25 ℃,150 r/min黑暗摇瓶培养3 d,获得均匀大小的菌丝球分布于培养基中可用于后续接种。

1.2.4 液体发酵 采用两步法发酵(摇瓶发酵加静态培养)的方式进行蛹虫草的液体发酵,在250 mL三角瓶中按培养基配方准确称取各类谷物,加入100 mL三级水搅拌均匀,121 ℃高压灭菌30 min,冷却后接入5%的种子液,25 ℃,150 r/min黑暗摇瓶培养5 d。之后将发酵液转移至已灭菌的平板中,在光照培养箱中静置培养至转色。

1.2.5 类胡萝卜素含量的测定 类胡萝卜素含量的测定在Dong等[5]的方法上略有修改,称取0.5 g液体发酵菌丝,加入1∶20的60%乙醇作为提取溶剂,50 ℃水浴提取30 min,8000 r/min离心10 min,上清液即为类胡萝卜素提取液,在紫外-分光光度计上进行全波长扫描,在400～600 nm中选择最大吸收波长445 nm作为类胡萝卜素的测定吸光值的波长,按以下公式计算类胡萝卜素含量:

式中,A:吸光度;V:提取剂用量(mL);D:提取液稀释陪数;E:消光系数(0.16);W:样品干重(g)。

1.2.6 发酵培养基的优化 以可食用的谷物粉(大米、小麦、大豆等)作为蛹虫草产类胡萝卜素液体发酵培养基的原料,蛹虫草生长合适的C/N为20∶1作为设计原则[17],以大米、小麦、玉米和麸皮按不同比例组合作为主要C源,大豆作为N源,根据各谷物的碳氮比[18](表1)按以下公式设计出表2的培养基配方,以基础发酵培养基作为对照,根据类胡萝卜素含量作为响应值得到3株蛹虫草的最佳液体发酵培养基配方。

式中，Ci为各谷物原料的含碳量,Ni为各谷物原料的含碳量,Xi为谷物质量。

表1 各谷物原料的碳氮比Table 1 C/N of each cereal material

表2 各培养基配方的原料组成Table 2 Raw material composition of each medium

注:碳源比例指大米、小麦、玉米和麸皮两两之间的比例组合;%是指每100 mL发酵液中各谷物的含量(g)。

1.2.7 类胡萝卜素提取工艺的研究 称取0.5 g的烘干蛹虫草菌丝,破壁处理之后,加入乙醇进行提取,8000 r/min离心10 min,取上清液于445 nm处测定吸光值,根据1.2.5中公式计算类胡萝卜素含量。

1.2.7.1 破壁方法对类胡萝卜素含量的影响 取烘干蛹虫草发酵菌丝0.5 g,破壁避光处理方法分别为超声处理、研磨处理和酶处理三种。研磨处理为加入0.5 g石英砂研磨10 min;超声处理为在500 W功率下超声10 min;酶处理包含纤维素酶、果胶酶,加入2%酶量处理,50 ℃水浴提取10 min,各处理方法完成后加入40%乙醇,料液比1∶20,室温提取30 min。

1.2.7.2 提取剂浓度对类胡萝卜素含量的影响 取烘干蛹虫草菌丝0.5 g,石英砂研磨10 min,加入乙醇浓度分别为0、20%、40%、60%、80%、100%,料液比1∶20,避光室温提取30 min。

1.2.7.3 料液比对类胡萝卜素含量的影响 取烘干蛹虫草菌丝0.5 g,石英砂研磨10 min,按照料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g/mL)加入60%乙醇,避光室温提取30 min。

1.2.7.4 提取温度对类胡萝卜素含量的影响 取烘干蛹虫草菌丝0.5 g,石英砂研磨10 min,加入料液比1∶40的60%乙醇,分别在4、30、50、70、90 ℃下避光提取30 min。

1.2.7.5 提取时间对类胡萝卜素含量的影响 取烘干蛹虫草菌丝0.5 g,石英砂研磨10 min,加入料液比1∶40的60%乙醇,在70 ℃下分别避光提取0.25、0.5、0.75、1、2和3 h。

1.2.8 正交实验 对提取剂浓度(A)、料液比(B)和提取温度(C)进行三因素三水平实验设计,因素水平表见表3。

表3 正交实验与水平因素Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.9 提取级数 在最佳提取条件下,进行多次提取,按以下公式测定各级的提取率,确定提取级数。

提取率(%)=各级的提取含量/总提取含量×100

1.3 数据处理

使用Origin 8.5软件进行数据处理和图形的制作;使用IBM SPSS Statistics 21软件进行数据的显著性分析(p<0.05)

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的优化

蛹虫草CM-03、CM-04和CM-11在各培养基中所产的类胡萝卜素含量结果如图1所示。从图1(A)可以看出,蛹虫草CM-03在大米-小麦培养基(配方E、F、G和H)和小麦-玉米培养基(配方I、J、K和L)中高产类胡萝卜素稳定,其中配方L含量最高,达到(694.8±15.4)μg/g,是对照基础发酵培养基313.1±16.3 μg/g的2.2倍。在大米-玉米培养基(A、B、C和D)中随着大米/玉米比例的减少而类胡萝卜素含量减少,在大米-麸皮培养基(M、N、O和P)中也随着大米/麸皮比例的减少而类胡萝卜素含量减少,这说明蛹虫草CM-03偏好大米作为产类胡萝卜素的最佳培养基。从图1(B)可以看出,蛹虫草CM-04在大米-玉米培养基、小麦-玉米培养基和大米-麸皮培养基中高产类胡萝卜素稳定,且在大米-玉米培养基中含量最高,达到(708.5±25.8) μg/g,是对照(259.0±9.0) μg/g的2.7倍。在大米-小麦培养基中随着大米/小麦比例的减少而类胡萝卜素含量减少,说明蛹虫草CM-04也偏好大米作为产类胡萝卜素的最佳培养基。从图1(C)可以看出,蛹虫草CM-11在大米-玉米培养基、大米-小麦培养基和小麦-玉米培养基中产类胡萝卜素稳定,其中配方K产量最高,达到(700.5±19.1) μg/g,是对照(346.8±22.0) μg/g的2.0倍。在大米-麸皮培养基中产类胡萝卜素不稳定,在大米/麸皮比例分别为1∶0.25和1∶1时含量高,而在1∶0.5和1∶0.75时产量较低。

本实验以可食用的谷物作为培养基来优化蛹虫草液体发酵培养基,研究发现,相比于使用速效碳源作为培养基,迟效碳源更适合蛹虫草产类胡萝卜素的研究。在通常情况下,速效碳源能被蛹虫草菌丝吸收利用并快速合成细胞结构物质,但代谢产物合成则受到抑制。而菌体对于一些结构复杂的碳源则吸收速度较慢,菌体生长缓慢,节约的原料和能源可以用于次级代谢产物的合成[19]。因此,迟效碳源更适合产物的积累,这在本文研究中也有相同的发现。付鸣佳[2]在PDA中添加蚕蛹粉通过平板培养的方式获得了472.3 μg/g的类胡萝卜素含量。沈俊良[20]在发酵培养基中添加2.5%玉米粉获得了558.4 μg/g的类胡萝卜素含量。在本研究中,发现在使用不同谷物的复合培养基时能有效提高类胡萝卜素的含量,并且在不同的配方比例下产量稳定。

图1 三株蛹虫草在各培养基中所产类胡萝卜素的含量比较Fig.1 Comparison of carotenoid contents of three strains of Cordyceps militaris in each culture medium注:A为蛹虫草CM-03在各培养基中所产类胡萝卜素的含量图;B为蛹虫草CM-04在各培养基中所产类胡萝卜素的含量图;C为蛹虫草CM-11在各培养基中所产类胡萝卜素的含量图;CK为基础培养基,大写字母代表不同的配方；不同小写字母代表差异显著(p<0.05)，图2～图6同。

2.2 提取工艺的研究

2.2.1 破壁方法的选择 选取了三种破壁处理方法提取蛹虫草发酵菌质中的类胡萝卜素,结果如图2所示。由实验结果可知,与对照相比,石英砂研磨、超声波破碎和酶处理可以提高类胡萝卜素的含量。其中相比于超声波破碎和酶处理,石英砂研磨成本最低且操作简单可行,所以选择石英砂研磨处理作为最优的破壁方法。

图2 破壁方法对类胡萝卜素提取含量的影响Fig.2 Effect of wall-breaking methods on extraction yield of carotenoids

2.2.2 乙醇浓度的确定 图3的实验结果显示,当乙醇浓度达到60%时,蛹虫草的提取量达到最高,此时,类胡萝卜素最大提取含量为(714.6±10.8) μg/g,低于或高于这个浓度时,类胡萝卜素的提取含量会显著降低(p<0.05),可能是由于蛹虫草类胡萝卜素中含有亲水性成分。虽然80%乙醇与60%乙醇在提取含量上并无显著差异,但出于用料成本的考虑,本研究选择60%乙醇作为最佳的提取液浓度。

图3 乙醇浓度对类胡萝卜素提取含量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of carotenoids

2.2.3 料液比的确定 由图4的结果可知,随着料液比的增加,蛹虫草类胡萝卜素的提取含量逐渐增加,直至料液比达到1∶40。随后,类胡萝卜素的提取含量出现下降。所以,选择1∶40作为最佳的料液比。

图4 料液比对类胡萝卜素提取含量的影响Fig.4 Effect of ratios of material to liquid on extraction yield of carotenoids

2.2.4 提取温度的确定 如图5所示,类胡萝卜素提取含量随着提取温度的增加而升高,这在张杰等[21]的研究中也有类似发现。但当提取温度超过70 ℃时,提取量开始出现下降,这一方面可能是由于高温能减少提取剂的体积,从而导致提取含量下降;另一方面可能是因为更高的温度导致类胡萝卜素出现降解。因此,选择70 ℃作为最佳的提取温度。

图5 提取温度对类胡萝卜素提取含量的影响Fig.5 Effect of temperature on extraction yield of carotenoids

2.2.5 提取时间的确定 提取时间对类胡萝卜素提取含量的影响如图6所示,实验结果发现提取时间对类胡萝卜素提取含量和提取剂体积并无显著影响,在提取3 h后含量并未显著减少,说明蛹虫草中类胡萝卜素耐高温,在70 ℃下结构稳定,这在许多研究中也有相同的发现[22]。

表5 类胡萝卜素提取级数的影响Table 5 Effect of extraction grade on extraction yield of carotenoids

图6 提取时间对类胡萝卜素提取含量的影响Fig.6 Effect of time on extraction yield of carotenoids

2.2.6 正交实验设计分析 由表4可得,对蛹虫草类胡萝卜素提取量的3个影响因素的主次顺序是A>C>B,表明乙醇浓度的影响对类胡萝卜素提取效果影响最大,其次是提取温度和料液比。实验结果显示最佳提取工艺为A2B2C3,即乙醇浓度60%,料液比1∶40和提取温度80 ℃。在最佳的提取工艺下,类胡萝卜素的提取含量为(1249.2±26.5) μg/g,符合实际提取结果。

表4 蛹虫草类胡萝卜素提取正交实验分析表Table 4 Orthogonal test of carotenoidsproduction from Cordyceps militaris

2.2.7 提取级数的确定 在最佳的提取工艺下,进行多次提取,测定各次的提取率,确定提取级数,结果见表5。由表5可知,第一次提取率达到了73.5%,第二次为19.3%,第三次为7.2%。前两次提取率可达92.8%,色素产量为1455.3 μg/g,因此确定提取级数为2级。

3 讨论

目前,在蛹虫草的液体发酵的研究中,大部分都是利用无机化学物质作为培养基来生产活性物质,如虫草素、虫草多糖等[23-25],很少有对有机复合物质进行研究,而利用谷物类作为培养基来生产类胡萝卜素未见报道。若能优化出适合某种活性物质高产的有机复合碳氮源培养基,那么就能减少很多化学试剂的使用,也能大大简化培养方法,普通大众的接受程度也会更高。在本文研究中,发现复合的迟效碳氮源比单一的速效碳氮源更有利于蛹虫草类胡萝卜素的产出,而且产量得到了显著的提高。实验结果还表明,不同蛹虫草在同一配方中类胡萝卜素积累量存在差距,同一蛹虫草在不同配方中也存在显著差异,说明蛹虫草对不同谷物培养基的亲和性存在差异,其中蛹虫草CM-03和CM-04偏好大米作为培养基,蛹虫草CM-11偏好小麦、玉米作为培养基。这在香菇、猴头菇和灵芝等食用菌中也有类似的发现[26]。

在蛹虫草类胡萝卜素的提取研究中,目前大部分都采用丙酮或石油醚等有机溶剂作为提取剂,虽然提取量较高,但难以去除,成本较高,其毒性也限制了其在食品中的应用[27-28]。在本文研究中,相比较于丙酮提取法,乙醇提取法更安全,可以获得食用级别的类胡萝卜素。同时,尝试了使用水为溶剂提取蛹虫草类胡萝卜素,结果表明在发酵菌丝、烘干子实体和新鲜子实体中只有在新鲜子实体中提取到类胡萝卜素的特征峰,这说明蛹虫草在不同的生长阶段可能所合成的类胡萝卜素结构性质不同,在子实体阶段其类胡萝卜素亲水性强,而新鲜子实体烘干后水溶性降低可能是由于烘干处理会影响其结构性质。而蛹虫草类胡萝卜素中具有哪些分子结构,有待于进一步研究。

4 结论

蛹虫草中含有的类胡萝卜素是一种稀有的天然色素,具有很强的亲水性,且耐高温。本实验为开发这一色素,从发酵培养基到提取工艺的研究都做了系统的优化。在培养基上,利用可食用的谷物作为培养基,研究了三株蛹虫草高产类胡萝卜素的最优配方。其中CM-03在小麦-玉米作为碳源的培养基上产量最高且稳定;CM-04在大米-玉米培养基上产量最高且稳定;CM-11也在小麦-玉米培养基上产量最高且稳定。在提取方法上,使用安全的乙醇提取法对类胡萝卜素的提取工艺进行了研究。通过正交实验确定了蛹虫草色素最佳提取工艺:采用石英砂研磨破壁,乙醇浓度60%,料液比1∶40,提取温度80 ℃,提取级数为2级,提取率达到92.8%。

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Optimizationoftheliquidculturemediumcomposition
forhighcarotenoidproductionbyCordycepsmilitaris
andtheinvestigationontheimprovementofcarotenoidextraction

YINLin1,2,LINJun-fang1,2,3,QIANJing1,YEZhi-wei1,2,LUOShi-hua1,GUOLi-qiong1,2,3,*,YUNFan3

(1.College of Food Science & Institute of Food Biotechnology,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China;2.Research Center for Micro-Ecological Agent Engineering and Technology of Guangdong Province,Guangzhou 510640,China;3.Alchemy Biotechnology Co.,Ltd.,of Guangzhou City,Guangzhou 510760,China)

TS201.2

A

1002-0306(2017)18-0079-06

2017-03-20

殷林(1991-),男,在读硕士研究生,研究方向:微生物资源的应用,E-mail:649431351@qq.com。

*通讯作者:郭丽琼(1962-),女,博士,研究方向:食药用菌活性物质的开发与利用,E-mail:guolq@scau.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31372116,31572178);广东省自然科学基金(2016A030313404)；广东省科技计划项目(2014B02 0205003;2014B050505018)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.016