小兴安岭地区野生蓝莓菌根真菌的分离和鉴定

贾鹏博，姜秀煜，王玉红，陈维建

(1.黑龙江省带岭林业科学研究所，黑龙江 伊春 153103；2.吉林省林业调查规划院)

小兴安岭地区野生蓝莓菌根真菌的分离和鉴定

贾鹏博1，姜秀煜1，王玉红1，陈维建2

(1.黑龙江省带岭林业科学研究所，黑龙江 伊春 153103；2.吉林省林业调查规划院)

试验利用2种不同的根段消毒方法从野生蓝莓植株的根系内分离出9株菌根真菌，其中5株分别命名为L1-L5，并对其进行形态观察与分子生物学鉴定，筛选出其中3株为杜鹃花科菌根真菌，结果如下：菌株L1属于杜鹃花类菌根真菌Meliniomycesvariabilis属真菌；菌株L2、L3为Phialocephalafortinii杜鹃花科菌根真菌；L4、L5为Fusariumoxysporum镰刀菌属。

野生蓝莓;菌根真菌;分离;鉴定

蓝莓(Blue Berry)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(VacciniumLinn.)植物，多年生灌木，其果实营养丰富，经济效益高，是潜力巨大的经济林树种。它为浅根系植物，根系不发达，无根毛，主要分布在浅土层。在自然条件下，蓝莓根系通常易与杜鹃花类菌根真菌形成互利共生的关系，它们形成一种特殊的菌根结构(又称欧石楠类菌根，ERM)。这类菌根可以促进蓝莓对营养元素的吸收，它可以帮助蓝莓直接利用土壤中的有机氮，并促进其对无机氮的吸收；促进蓝莓对难溶性P，特别是无机P 的吸收；还可以促进蓝莓对S、Ca、Cu、Zn、Mn、Fe 等其他元素的吸收；而当重金属元素供应过量时，又能起到缓解作用，有菌根真菌侵染的植株，明显表现出生长量大而且产量高[1]。菌根真菌还可以分泌有机酸，促使一些不易溶解的无机和有机化合物转化为可溶态养分，被蓝莓吸收。

笃斯越桔(Vacciniumuliginosum)，又称野生蓝莓，在小兴安岭地区资源丰富，蕴含丰富的菌根真菌资源。本试验观察并分离小兴安岭地区笃斯越桔的菌根真菌，并对分离出的菌根真菌进行鉴定，为进一步保护和应用野生蓝莓菌根真菌资源做好基础工作。

1 试验材料

1.1 植物材料

2015年5月从伊春市友好区翠北林场采集健康野生蓝莓附带根基土壤的根样，用已灭菌的采样袋带回实验室，存放在4℃冰箱内，尽快取样并观察、分离菌根真菌。

1.2 菌种用培养基

分离菌种采用PDA培养基：配置1L溶液所需材料(马铃薯去皮切成小块200 g，葡萄糖20g，琼脂16～18g，蒸馏水1000mL)，于电磁炉上煮沸保持20min，用4层纱布过滤得到滤液，pH自然；121℃灭菌20min，待用[2]。

2 试验方法

2.1 根样品预处理

取出野生蓝莓菌根真菌根样，选择新鲜、健康的根样，轻轻去除其表面的苔藓及土壤，放在自来水下冲洗，冲洗时间约为2h，冲洗干净后的菌根用干净的吸水纸吸掉根表面的水分，剪成0.5cm的根段，备用。

2.2 侵染率计算

将预处理根样于FAA固定液中固定24h，取出后放在10%KOH溶液中水浴(90℃)20～60min；然后取出用自来水轻轻冲洗根系至无色；将上述处理的根段进行锥虫蓝染色(染液配方：锥虫蓝0.05g+苯酚20g+乳酸20mL+甘油40mL+蒸馏水20mL)，室温下12h；将染色的根段取出于甘油中脱色，于光学显微镜下观察，计算侵染率。

2.3 菌根菌的分离、纯化

采用PDA培养基，利用根段直接分离法分离菌根真菌。将洗净的根系，用以下两种方式进行根系表面灭菌：①将根段放入75%的酒精溶液中，灭菌30s，用无菌水冲洗3次，然后用0.1%的氯化汞溶液消毒2min，无菌水冲洗3次。②将根段放入75%的酒精溶液中灭菌2min，再用5%NaClO溶液浸泡12min，用无菌水冲洗3次。在超净工作台中将灭菌的根段切成1cm长，将根段放入平皿上，每个培养皿中放入3个根段，将培养皿放入培养箱中，25℃恒温避光倒置培养，每种处理设3个重复。待根段切口处长出菌丝后用接种环挑取菌丝将其移至无菌空白PDA培养基上进行纯化培养，直至得到单一菌落。

2.4 菌根真菌鉴定

2.4.1 形态观察。将纯化后的菌种在PDA培养基上进行纯培养后，对其菌落的形态特征进行观察和记录。

2.4.2 分子鉴定

2.4.2.1 仪器耗材：通过rDNA的18S序列进行菌株鉴定。

表1 实验主要仪器耗材

(1)真菌基因组提取

1)从培养基中挑取真菌，尽量去除琼脂。

2)加入200μL植物lysis buf，研磨至粉状。

3)加入600μL植物lysis buf，0.8μL β巯基乙醇，充分混匀。

4)65℃水浴40min，12000rpm，10min离心。

5)去上清，加等体积氯仿抽提，12000rpm，5min离心。

6)加入700μL植物Binding buf，上柱静置5min。

7)12000rpm，2min离心。

8)加入500μL 80%乙醇洗2次，12000rpm，1min离心。

8)室温静置10min挥发晾干，加40μL H2O，静置5～10min。

9)换新管，13000rpm，2min离心，管底即为基因组。

目的片段扩增：

引物合成：

NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC

NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA

反应体系

表2 反应体系

反应条件：

回收PCR产物

1)2.0%琼脂糖凝胶电泳，切取目的片断。

2)加入回收试剂溶液A 300μL/0.1g，6 0℃水浴至胶完全溶化。

3)加入50μL回收试剂溶液B，混匀。

4)将溶液置于离心柱中，静置5min，12000rpm，1min，弃液体。

5)加入500μL 80%乙醇，12000rpm，离心1min，弃液体，重复1次。

6)12000rpm，离心5min，甩干余液，弃液体，晾干5～8min。

7)将离心柱置于新的离心管中，加入30μL灭菌双蒸水，静置10min。

8)13000rpm，离心3min，管底即为纯化产物，取3μL电泳检测。

(2)测序比对

以上试验由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司完成，所得的产物序列通过National Center Biotechnology Information(NCBI)核算数据库利用Blast程序搜索得到结果。

3 结果与分析

3.1 侵染率

经锥虫蓝染色法染色后真菌组织呈蓝色，按照侵染率计算公式计算，通过光学显微镜观察，野生蓝莓内生菌根菌的侵染率约为60%。实验观察发现野生蓝莓菌根真菌侵染率高的根段为分枝多直径很细的根段，粗壮分枝少的根系侵染率很低。说明小兴安岭地区野生蓝莓根系菌根真菌资源丰富。见图1。

图1 左为野生蓝莓根段 右为野生蓝莓菌根侵染形态

3.2 菌根真菌的分离

本试验采用根段培养法，采取两种消毒方法进行培养。

培养5天后，根段切面处长出白色菌丝(图2)，可以推测此菌丝为蓝莓根段内共生真菌。采用的两种消毒方法中，方法1分离出3个菌落，方法2分离出6个菌落。方法1分离出来的菌落较少，可能是由于酒精、升汞处理的造成菌丝的死亡。但是方法2的消毒方法根段污染率明显高于方法1。

图2 分离出的菌根真菌

图3 2种方法对菌根真菌分离数量的影响

采用根段直接培养法分离野生蓝莓菌根真菌，采用2种根段表面消毒法。不同消毒方法得到的菌落数不同，方法2得到的菌落数稍多，但是根段污染率极高，不易纯化，而方法1消毒方法根段几乎没有污染，纯化简单。说明消毒时间及方法不同分离得到的真菌数量不同，纯化难易程度也不相同。经过筛选，淘汰了常见的腐生性真菌，初步得到5株单菌落。分别命名为L1～L5。

3.3 菌株培养特征

表3 分离得到的菌落特征(PDA培养基，25℃)

3.4 菌株鉴定

本研究通过对真菌的rDNA的ITS序列分析，对5个菌株进行分子生物学鉴定，通过18s rDNA检测技术，从核酸水平鉴定菌株并进行分类鉴定可以很大程度地提高菌种分类鉴定的准确率。

利用以上真菌的rDNA的ITS作为通用引物对供试的菌株扩增得到rDNA序列，将得到的序列通过GeneBank上的BLAST局部相似性查询系统，搜索和待测菌株最相似的序列，并比较分析。菌株L1属于杜鹃花类菌根真菌Meliniomycesvariabilis属真菌。菌株L2、L3为Phialocephalafortinii杜鹃花科菌根真菌。L4、L5为Fusariumoxysporum镰刀菌属。5株菌株中有2株为镰刀菌属，说明可能植物本身正处在非内生性病原菌感染的初期，这样我们分离得到的真菌就不是目的内生真菌。

表4 4株内生真菌的BLAST结果

采用的根段分离法对野生蓝莓菌根真菌进行分离，此法虽然是国内外分离欧石楠类菌根真菌最普遍的方法，但其本身也存在其自身的局限性。首先，即使选取的根系没有病害症状等，但也可能有潜在的病原菌存在，本试验中，分离出的镰刀菌属被确定是潜在的致病菌。第二，有些菌根真菌并不一定能在人工培养基上生长，从而不能将其从植物组织内的内生真菌全部被分离出来，第三，菌根真菌长期生活在植物组织内部，与宿主植物协同进化，为适应微环境其形态特征会发生一定变化，因此，传统的形态学分类标准能否准确反映出真实分类地位有待探讨。

由此可见，创建从活体植物根系组织内直接检测和鉴定内生真菌的技术体系是非常必要的。对植物根段的消毒时间也是影响分离效果的主要因素，何映霞研究珙桐内生真菌的实验表明，不同的消毒时间分离得到的真菌数量是不同的。消毒时间过长，可能会杀死一些内生真菌，从而不能完全分离出植株内生真菌；消毒时间过短，可能不会完全杀死植物根系组织表面的杂菌，干扰实验结果[3]。

我们将用本次试验分离出的杜鹃花科菌根真菌接种于蓝莓苗中，观察其对蓝莓植株生长的促进作用，为实际应用提供理论依据。

[1]顾姻，贺善安.蓝浆果与蔓越橘[M].北京：中国农业出版社.2001

[2]郑文龙，朱慧芳.产紫杉醇内生真菌EFY-21的鉴定与生物学特性研究[J].菌物研究，2010，8(1)：35-39.

[3]何映霞.珙桐产黄酮内生真菌的分离及鉴定[J].贵州，贵州大学，2008.

2017-06-09

S663.9

A

DOI.∶10.13268/j.cnki.fbsic.2017.05.008