基于Mn掺杂ZnS量子点室温磷光法检测盐酸巴马汀

安昭琦， 栗东霞， 于建敏， 闫桂琴

(山西师范大学生命科学学院，山西临汾 041000)

掺杂半导体量子点(Quantum Dots，QDs)作为一种新型的纳米材料,具有独特的光学、电学和磁学性质，可以应用于电子发光器件、荧光标记和生物分析等领域[1]，尤其是室温磷光(Room Temperature Phosphorescence,RTP)量子点在很多领域具有潜在的应用价值。磷光相对于荧光检测选择性更强，寿命更长，可以有效避免生物体液的背景荧光和散射光干扰[2 - 3]。此外，由于磷光相对于荧光是一种更少见的现象，选择性也更好[4]。因此，RTP检测法备受关注。

盐酸巴马汀(Palmatine Hydrochloride，PaH)是一种异喹啉生物碱，可由毛茛科植物黄连及防己科植物金果榄的根部和防己科植物黄藤的茎中提取得到[5 - 6]，具有抗炎[7]、抗肿瘤[8]和抗菌等药理药效作用[9 - 10]。临床上PaH常用于治疗妇科炎症、肠炎、外科感染、眼结膜炎、呼吸道及泌尿道感染等[11]。但服用该药会出现眩晕、恶心等症状，若服用剂量较大则对呼吸中枢有一定抑制作用，有时还可引起锥体外系症状。因此，建立一种检测生物体液中PaH含量的方法十分必要。目前，测定PaH的方法主要有共振光散射法[12 - 13]、高效液相色谱法[14 - 15]、紫外-可见光谱法[16]和荧光光谱法[17]。尽管这些方法检测PaH有效，但也存在着各种不足，如共振光散射法需要酸性或碱性环境；高效液相色谱法需要复杂的预处理、分析时间长、仪器昂贵；紫外-可见光谱与荧光光谱法容易受自体荧光和散射光的干扰。因此，基于中性环境建立一种低成本、耗时少、操作简单、灵敏高效检测PaH的方法具有重要的现实意义。

本文以3-巯基丙酸(3-Mercaptopropionic Acid，MPA)包裹的Mn掺杂ZnS量子点(Mn∶ZnS QDs)为室温磷光探针，利用PaH与量子点发生静电作用，使得Mn∶ZnS QDs发生室温磷光猝灭效应，从而建立了一种简单、快速、灵敏且选择性好的测定痕量PaH的方法，该方法可有效用于生物体液中PaH的快速测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

采用Rigaku D/max-2500 X-射线粉末衍射仪(日本，理光公司)对量子点进行表征。荧光光谱和磷光光谱在Cary Eclipse荧光分光光度计(美国，瓦里安公司)上进行测定。pHS-3C型pH计(上海雷磁公司)。AEU-200电子天平(日本，岛津公司)。

盐酸巴马汀标准品(PaH，上海曼思环境科技有限公司);Zn(Ac)2·2H2O、Mn(Ac)2·4H2O、NaS·9H2O、NaH2PO4、Na2HPO4(天津科密欧化学试剂有限公司);3-巯基丙酸(MPA，北京百灵威科技有限公司);实验所用试剂均为分析纯。高纯水(18.2 MΩ· cm)采用WaterPro水纯化系统(美国Labconco公司)制备。

1.2 实验方法

1.2.1MPA包裹的Mn∶ZnSQDs的合成参考文献方法[18]并做适当改进：在250 mL三颈烧瓶中，依次加入2 mL 0.01 mol/L Mn(Ac)2，5 mL 0.1 mol/L Zn(Ac)2和50 mL 0.04 mol/L MPA溶液，用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至11，在室温下磁力搅拌，并通氩气饱和30 min，确保稳定剂MPA与Zn2+和Mn2+充分络合后，加入5 mL 0.1 mol/L Na2S溶液，在室温下继续反应20 min后，将得到的溶液MPA包裹的ZnS∶Mn QDs溶液在50 ℃ 下陈化2 h，用相同体积的无水乙醇使量子点沉淀，高速离心，洗涤2～3次，室温真空干燥24 h，即得MPA 包裹的Mn∶ZnS QDs固体粉末。

1.2.2室温磷光检测在一系列10 mL比色管中，依次加入500 μL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)，35 μL 2 mg/mL的MPA包裹的Mn∶ZnS QDs水溶液，及不同浓度的PaH溶液，用高纯水定容至5 mL，充分摇匀，静置10 min后进行磷光检测。

1.2.3样品检测尿液收集于健康志愿者，分析前将其用高纯水稀释100倍即可，无需进一步处理。

2 结果与讨论

2.1 MPA包裹的Mn∶ZnS QDs的表征

图1(A)为X-射线衍射(XRD)表征图谱。如图所示，在2θ=29°、48°和57°的三个衍射峰分别对应于立方型闪锌矿结构的(111)、(220)和(311)三个晶面的衍射光谱，表明所合成的Mn∶ZnS QDs具有典型立方晶体结构。通过荧光分光光度计测定该Mn∶ZnS QDs 的最强激发峰为295 nm，最强发射峰为590 nm(图1(B))，与文献报道[19 - 20]一致，说明量子点成功制备。由于ZnS是宽禁带半导体材料，Mn2+与Zn2+的价态相同，离子半径相近，使得Mn2+能够很好的渗入到Zn2+晶格中，并且不会对ZnS的结构产生影响。量子点在295 nm 处有很强的磷光发射峰，是因为当激发光被ZnS 母体吸收后其电子受到激发，空穴则被Mn2+捕获，电子和空穴各自在Mn2+上复合从而导致Mn2+的激发，然后以磷光形式释放能量。在这一过程中Mn2+发生了从三重态(4T1)到基态(6A1)的跃迁，并在590 nm 处发出橙红色的磷光。

图1 (A)Mn∶ZnS QDs的X-射线衍射(XRD)图谱；(B) Mn∶ZnS QDs的激发光谱与发射光谱 Fig.1 (A) XRD image of Mn∶ZnS QDs;(B) The excitation and emission spectra of Mn∶ZnS QDs cQDs:14 mg/L；PBS buffer:20 mmol/L；pH=7.4.

2.2 实验条件的优化

为了实现对PaH的灵敏检测，对pH值、反应时间及NaCl的浓度进行了优化。由图2(A)可知，Mn∶ZnS QDs 的室温磷光强度IRTP与pH值密切相关。结果表明，pH值在7.0～7.4时相对稳定。由于生理pH值为7.4，所以选择pH=7.4作为该实验的缓冲液。同时，量子点的IRTP在10～40 min内(图2(B))和较高的盐浓度下(0.3 mol/L)基本保持稳定(图2(C))。

图2 pH(A)、时间(B)和NaCl浓度(C)对Mn∶ZnS QDs IRTP的影响 Fig.2 Effect of pH(A),time(B)and NaCl concentration(C) on the IRTP of Mn∶ZnS QDs cQDs:14 mg/L；cPaH:3 μmol/L.

2.3 Mn∶ZnS QDs对PaH的响应

在最佳条件下，研究了MPA包裹的Mn∶ZnS QDs的室温磷光猝灭强度(ΔIRTP)与PaH 浓度之间的关系。随着PaH浓度的增大，Mn∶ZnS QDs的IRTP在590 nm处呈规律性猝灭(图3(A))。当PaH的浓度在0.75～30 μmol/L范围时与ΔIRTP呈线性关系(图3(B))，线性方程为:ΔIRTP=52.133cPaH+36.14，相关系数R=0.996，检出限(3σ)为0.35 μmol/L。

图3 (A)PaH浓度对Mn∶ZnS QDs的IRTP的影响；(B)PaH浓度与ΔIRTP的校正曲线Fig.3 (A) Effect of PaH concentrations on IRTP of Mn∶ZnS QDs;(B) Calibraation curve between cPaH and ΔIRTP(A)cQDs:14 mg/L；cPaH：a-j.0，0.75，1.5，3.0，6.0，10.5，15.0，19.5，24.0，30.0 μmol/L;(B) cQDs:14 mg/L；cPaH：0.75，1.5，3.0，6.0，10.5，15.0，19.5，24.0，30.0 μmol/L.

2.4 PaH与量子点的作用机制

荧光光谱图(图4(A))显示，量子点(曲线a)中加入PaH(曲线b)后荧光明显加强(曲线c)，但加强效应并非二者数据简单叠加(曲线d)所致，表明PaH和MPA包裹的Mn∶ZnS QDs 之间发生了相互作用，且形成了新的物质。

图4 (A) 荧光光谱图；(B) Mn∶ZnS QDs的Lineweaver-Burk图和Stem-Volmer图Fig.4 (A) Fluorescence spectra;(B) Lineweaver-Burk Graph and Stem-Volmer Graph of Mn∶ZnS Dots(A) a.QDs;b.PaH;c.QDs/PaH;d.QDs+PaH;cQDs:14 mg/L;cPaH:3 μmol/L.(B) cQDs:14 mg/L；cPaH:0.75，3.0，6.0，10.5，15.0，19.5，24.0，30.0 μmol/L.

由于量子点表面存在大量羧基，呈电负性，而PaH为异喹啉生物碱，其分子中有不饱和的N原子，使其在水溶液中呈正电性，因此二者极易通过静电作用而结合。因此，当体系中加入PaH 后，PaH作为一种阳离子电子受体，可能通过静电吸引与MPA包裹的Mn∶ZnS QDs形成复合物，进而从量子点捕获电子并阻止量子点内电子与空穴的正常复合，量子点电子从激发态返回基态时以光能形式释放能量受到障碍，变为非辐射跃迁，这是导致量子点磷光猝灭的主要原因。

磷光猝灭过程通常分为动态和静态猝灭，动态猝灭遵从Stem-Voliner方程(1)，静态碎灭遵从Lineweaver-Burk方程(2)[21 - 22]：

P0/P=1+KSV

(1)

1/(P0-P)=1/P0+KLB/(P0cPaH)

(2)

其中，P0代表磷光体磷光强度，P代表加入磷光碎灭剂后体系的磷光强度，cPaH为猝灭剂的浓度，KSV是动态猝灭常数，KLB是静态猝灭常数[23 - 25]。图4(B)为实验数据拟合出来的曲线，P0/P和cPaH的关系不遵循Stem-Voliner方程，而P0-P与cPaH的关系符合Lineweaver-Burk方程，说明PaH猝灭Mn∶ZnS QDs是一个静态猝灭过程。

图5为MPA包裹的Mn∶ZnS QDs与PaH的反应机理图。

图5 (A) 基于MPA包裹的Mn∶ZnS QDs检测PaH的反应机理图;(B) MPA包裹的Mn∶ZnS QDs结构;(C) PaH分子结构Fig.5 (A) Mechanism of PaH detection using the MPA capped Mn∶ZnS QDs;(B) Structure of MPA capped Mn∶ZnS QDs;(C) Structure of PaH

2.5 共存物质的干扰

在最佳条件下，考察了共存物质的影响(表1)。结果表明，在PaH浓度为3 μmol/L时，250倍的K+,800倍的Na+,100倍的葡萄糖，100倍的蔗糖,200倍的果糖，15倍的L-谷氨酸(L-Glu)，15倍的L-精氨酸(L-Arg)，50倍的L-赖氨酸(L-Lys)，100倍的L-酪氨酸(L-Tyr)，100倍的L-丙氨酸(L-Ala)，150倍的L-脯氨酸(L-Pro)，400倍的DL-甲硫氨酸(DL-Met)对Mn∶ZnS QDs的影响均不大。其他阳离子药物存在，会对实验结果产生或多或少的干扰：若其他阳离子药物浓度较小，对检测体系几乎没有干扰；若浓度较大，则会产生干扰。但在实际药物使用中，PaH功能主治与其他阳离子药物虽有相似之处，但同时服用的可能性很小。因此，用Mn∶ZnS QDs的PaH具有较高的准确性和潜在的适应性。

表1 生物体液物质干扰Table 1 Effect of co-existing substances

图6 尿液的磷光(a)和荧光(b)光谱图Fig.6 Phosphorescence(a) and fluorescence(b) spectra of urine

2.6 实际样品分析

为考察MPA 包裹的Mn∶ZnS QDs的室温磷光检测PaH的可行性，进行了尿液的加标回收实验。图6显示，人尿液无背景磷光(曲线a)，却有较强的背景荧光(曲线b)，表明该检测方法能有效避免生物体液中其他物质的荧光干扰。进一步说明了本方法只需将待测液稀释100倍，不需要进行其他复杂的预处理。PaH的回收率为94.0%～103.3%(表2)。因此，该方法适合人体液中痕量PaH的检测。

表2 基于MPA包裹的Mn∶ZnS QDs的RTP法检测PaHTable 2 Detection of PaH by RTP method based on Mn∶ZnS QDs

3 结论

基于3-巯基丙酸包裹的Mn：ZnS QDs的室温磷光性质，利用盐酸巴马汀与Mn∶ZnS QDs发生静电作用，使得Mn∶ZnS QDs的磷光发生有效猝灭，并实现了生物体液中痕量盐酸巴马汀的检测，其线性范围为0.75～30 μmol/L，检出限为0.35 μmol/L，加标回收率为94.0%～103.3%。该方法成本低、操作简单、检测方便且不受体液背景荧光和散射光的干扰。