高效液相色谱法手性拆分(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基) 二苯基磷酸酯对映体

王 舒， 韦思平， 王 力， 陈碧琼， 张 春， 王 钦， 杜 曦*

(1.西南医科大学药学院，四川泸州 646000； 2.西南医科大学基础医学院，四川泸州 646000)

图1 (2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯结构Fig.1 Molecular structure of (2-pentyl-3-phenyl-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate

环氧化合物是重要的药物合成中间体，经反应可以得到一系列具有生物活性的药物[1]，如以(R)-环氧氯丙烷为原料合成的(S)-美托洛尔是一种选择性的β1受体阻滞药[2]。某些环氧化合物本身也具有生物活性，例如，以环氧乙烷环己烯酮为骨架的α-环氧拉帕醌对亚马逊利什曼原虫具有抑制作用[3]。理想的药物须具有相应的生物活性，同时还应有相当的稳定性、选择性和生物利用度等，因此对药物分子进行修饰以改善其生物特性显得十分重要，而磷酸酯化是一种常用的重要修饰手段[4]，如恶唑烷类抗生素泰地唑利[5]，在引入磷酸酯基后，其生物利用度和酸碱稳定性均得到提高。作者所在课题组已合成的2-戊基-3-苯基-2,3-环氧丙醇及其类似物在初步的抗肿瘤实验研究中显示出了一定的活性，为进一步提高活性，考虑在其分子结构中引入磷酸酯基团以制备环氧磷酸酯类化合物，以期提高生物利用度、稳定性以及对细胞膜的通过性，进而产生更强的抑制作用。手性前体化合物2-戊基-3-苯基-2,3-环氧丙醇进行磷酸酯化反应可获得手性的环氧磷酸酯类化合物。

手性化合物的对映体往往具有不同的生理活性[6 - 8]，因此进行手性环氧磷酸酯化产物对映体过量值(ee值)的测定，对磷酸酯化反应条件的调控及产物纯度的检测具有非常重要的意义。目前，未见高效液相色谱法拆分(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯(图1)对映体的相关报道。因此，本文对(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯对映体进行了较深入的高效液相色谱拆分研究，以期为该类化合物的手性拆分提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters1525-2487型高效液相色谱仪(美国,Waters公司)；KQ5200型超声脱气机(昆山市超声仪器有限公司)。

正己烷、异丙醇、乙醇(色谱纯，美国Fisher试剂公司)；1,3,5-三叔丁基苯(上海阿达玛斯公司)。(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯(西南医科大学药物化学平台提供)。

1.2 样品制备

取3 mg (2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯，加入1.5 mL正己烷，超声混匀后作为母液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Chiralcel OD-H、Chiralpak AD-H、Chiralpak AS-H(250×4.6 mm i.d.，5 μm),流动相：正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇，使用前用0.45 μm滤膜过滤并超声脱气15 min；流速：0.6～1.4 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：20～35 ℃；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 手性柱的选择

图2 (2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯在不同手性柱上的色谱图Fig.2 Chromatograms of (2-pentyl-3-phenyl-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate on different chiralcel columns(a)Chiralcel OD-H column;(b) Chiralpak AS-H column;(c) Chiralpak AD-H column.mobile phase:n-hexance-isopropanol(90∶10,V/V;flow rate:1.0 mL/min;column temperature:25 ℃.

分别考察了Chiralcel OD-H、Chiralpak AD-H、Chiralpak AS-H三种手性色谱柱对(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯对映体的拆分情况，结果见图2。结果显示，(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯对映体在Chiralcel OD-H柱上不能实现完全分离(分离度RS<1.5)，但是在Chiralpak AD-H、AS-H柱上均可完全分离。有趣的是，我们前期对该样品的手性前体化合物2-戊基-3-苯基-2,3-环氧丙醇进行了拆分研究，结果显示该手性前体化合物在Chiralcel OD-H柱上可完全分离(RS=1.626)，而在Chiralpak AD-H和AS-H柱上基本不能分离[9]。Chiralcel OD-H柱的固定相是以β-1,4糖苷键连接形成的纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；而Chiralpak AD-H和Chiralpak AS-H柱的固定相是以α-1,4糖苷键连接形成的淀粉型固定相，AD-H的衍生基团是三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，AS-H为三(S-α-甲基苯基氨基甲酸酯)。不同的糖苷键连接方式导致所形成的固定相的空间结构不同[10]，以直链淀粉为固定相的Chiralpak AD-H和AS-H柱对(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯对映体表现出不错的拆分能力，而对其手性前体2-戊基-3-苯基-2,3-环氧丙醇则不能完全分离，可能是由于直链淀粉所形成的螺旋空间结构与(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯的分子大小更匹配，导致该对映体与直链淀粉固定相之间的作用力更强，拆分效果更好。对于同样以螺旋结构的直链淀粉为固定相的Chiralpak AD-H和AS-H柱，由于其衍生基团不同导致分离效果仍存在差异。AD-H柱的衍生基团中，氨基氮原子直接与苯环相连，使该氮原子周围的电子云强烈偏向苯环，氨基氢正电性增强，更易于与(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯分子中的氧原子形成氢键，且其苯环上连接的两个供电子的甲基，使苯环上的电子云密度增强，从而π-π作用力增强，所以对映体在AD-H柱上的分离度高于AS-H柱，这表明AD-H柱可以有较高的载样量。兼顾分离度和分离时间两个因素，本实验采用Chiralpak AS-H柱进行拆分实验。

2.2 流动相的选择

分别考察了以正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇作流动相时，(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯对映体在Chiralpak AS-H上的拆分情况，结果见表1。可以看出，以乙醇含量等于或小于10%的正己烷-乙醇作为流动相时，对映体可完全分离(RS≥ 1.625)；以正己烷-异丙醇为流动相时，异丙醇含量从5%增加到20%时均可实现对映体的完全分离(RS≥ 2.968)。随着醇含量降低，保留时间(t)、容量因子(k)和分离度(RS)均不同程度的增大。基于对保留时间、分离度及柱压等因素的综合考虑，选择正己烷-异丙醇(85∶15,V/V)作为流动相进行拆分实验。

表1 流动相组成对分离的影响

2.3 流速的选择

以正己烷-异丙醇(85∶15,V/V)为流动相，考察0.6～1.4 mL/min的流速范围内，手性AS-H柱对(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯对映体的分离情况,见表2。结果表明，随着流速的增加，保留时间(t)、理论塔板数(N)和分离度(RS)均有明显降低，分离因子(α)基本不变。其主要原因是增加流速，样品与固定相之间相互作用达到分配平衡的次数减少，导致理论塔板数和分离度降低。由于对映体在两相中分配系数相对恒定，所以分离因子基本不变。综合考虑分析时间和分离度，最终选择1.0 mL/min作为拆分流速。

表2 流速对分离的影响

2.4 温度的选择

在已优化的色谱条件下，考察柱温在20～35 ℃时对(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯对映体拆分的影响，结果见表3。在一定的温度范围内，随着温度的升高，分离因子(α)基本保持不变，

表3 柱温对分离的影响

而保留时间(t)、容量因子(k)及分离度(RS)均呈减小的趋势，但均可实现完全分离。这可能是由于温度升高，样品与固定相之间氢键作用力、π-π作用力以及偶极作用力减小，导致保留时间、容量因子随之减小；同时，温度升高可能导致了固定相对对映体的手性识别作用力的差值减小，从而导致分离度的减小[11]。考虑到温度对手性柱使用寿命的影响，最终选择25 ℃作为分离柱温。

2.5 方法的线性范围及定量限

精密吸取(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯母液，配制成0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 mg/mL 的系列对照品溶液，在已优化的色谱条件下依次进样，考察峰面积(Y)与样品质量浓度(X)的线性关系。(2R,3R)-(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯线性方程为:Y1=6000000X-63154(R2=0.9996)；(2S,3S)-(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯线性方程为：Y2=5000000X-79943(R2=0.9995)。线性良好，满足实验要求。将母液逐级稀释，在上述条件下进行检测，定量限以10倍信噪比(S/N=10)计算，结果为0.008 mg/mL。

2.6 重复性

取已配制的1.2 mg/mL的(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯溶液，在已优化的色谱条件下，连续进样6次，记录色谱图。6次进样的分离度的相对标准偏差(RSD)为1.70%，保留时间的RSD分别为1.43%、1.42%，重复性较好。

2.7 方法的应用

在已优化的色谱条件下，对本课题组合成的(2R,3R)-(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯进行对映体过量值测定，结果显示产物对映体过量值(ee值)可达92%，见图3。将该方法应用于本课题组合成的其他不对称环氧化磷酸酯化产物的拆分，分离度RS均大于1.8，见图4。

图3 (2R,3R)-(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯在Chiralpak AS-H上的色谱图Fig.3 Chromatogram of (2R,3R)-(2-pentyl-3-phenyl-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate on AS-H column

图4 (2R,3R)-(2-甲基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯(a)和(2R,3R)-(3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯(b)在Chiralpak AS-H上的色谱图Fig.4 Chromatograms of (2R,3R)-(2-methyl-3-phenyl-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate (a) and (2R,3R)-(3-pheny-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate (b) on AS-H column

3 结论

建立了一种快速拆分(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯光学对映体的高效液相色谱方法，在Chiralpak AS-H柱上，以正己烷-异丙醇(85∶15,V/V)为流动相，在柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm的条件下，可实现对映体的完全分离。将该方法应用于(2-戊基-3-苯基-2,3环氧丙烷基)二苯基磷酸酯类似物的手性拆分，均取得理想效果。