基于纸基微流控芯片的农药残留光电检测方法

杨 宁，李 振，毛罕平，王 盼，项昌华，孙 俊



基于纸基微流控芯片的农药残留光电检测方法

杨 宁1,2，李 振1，毛罕平2※，王 盼1，项昌华1，孙 俊1

（1. 江苏大学电气信息工程学院，镇江 212013；2. 江苏大学农业工程研究院，镇江 212013）

针对当前农药检测设备所存在的造价高、自动化程度低、试剂耗材量大等问题，提出一种基于纸基微流控芯片的农药光电检测方法。设计一种简单、便携、廉价的纸基微流控芯片。构造桥式复合结构提升微流控酶抑制显色反应的均匀度，设计适用于光吸收反射检测的光路及电路结构，最终创建集化学反应、光吸收反射效应及环境参数控制于一体的便携化农药检测系统试验平台，并对试验平台最佳工艺参数进行测定与优化。试验结果表明：在达到国家检测标准的前提下，所述检测法分辨率可达0.002 mg/L，高于农药速测卡法；在农药检测浓度范围内，所述方法与yps-1 168型便携式农药检测仪检出限相当，但试剂消耗价格降低了94.79%，且检测时间缩短23%。因此设计的纸基微流控芯片农药光电检测系统，为农残检测的便携化研制发展奠定理论基础。

农药；农产品；快速检测；纸基微流控芯片；光电检测；分辨率

0 引 言

根据国务院统计数据显示，因摄入含农药残留的食品和蔬菜而致癌的人数每年增加15%[1-[2]]。因此，便携化、普及化的农残检测装备已成为大众食品安全的重要保障[3-6]。

目前，农药快速检测方法根据原理大致分为酶抑制法、光谱检测法和色谱检测法等[7-11]。光谱法和色谱法所需设备昂贵，无法便携化与普及化应用[12-15]；酶抑制法具有快速、操作简便等特点，已成为便携式农药检测的主要方法[16]。传统的酶抑制速测法主要依赖酶抑制显色化学反应在速测卡片上比色判别。该方法检测速度快，检测成本低，但裸眼观测使得检测精确度较低。此外，化学反应需要手动操作，引入较多人为误差，容易出现误判[17]。因此，自动化程度高，经济便捷的农药残留检测装备已成为国内外研究热点[18]。

随着微机电加工工艺的突飞猛进，一种将生化样品检测中的进样、反应以及检测等过程集成于一体自动完成的微流控技术引起了农残检测领域国内外专家学者的广泛关注[19-20]。美国学者Duford等利用微流控技术实现 了对呋喃丹农药的快速检测[21]。复旦大学郭红斌利用微流控技术实现了甲基对硫磷农药的快速检测[22]。微流控检测技术已被Business2.0杂志列为改变世界的七大技术之一[23]。2010年兴起的纸基微流控芯片技术远远降低了传统微流控芯片的加工成本和制备难度，进一步推动了便携化农药检测技术的发展[24]。Bhakta等建立纸基微流控分析设备来量化唾液中亚硝酸盐的含量[25]。Wang等采用化学发光法在纸基微流控芯片进行农药检测[26]。由于纸的不透光性，大多数农药残留需要借助电化学工作站进行检测，然而，电化学工作站成本较高、体积大，且微弱的电流信号易受环境干扰[27]，仍然难以实现便携化、普及化应用。

论文根据光的吸收反射原理[28]，提出一种基于纸基微流控芯片的农药光电检测方法，该方法装备构造简单，成本低，自动化程度高且与纸基微流控芯片集成度高。

1 工作原理

1.1 化学反应原理

酶抑制反应原理即是靛酚乙酸酯（C14H11NO3）可水解为靛酚（C12H9NO2）和乙酸（CH3COOH），而所采用乙酰胆碱酯酶（AchE）可催化靛酚乙酸酯水解过程，所生成物靛酚（C12H9NO2）显蓝色[29]。农作物中的有机磷或者氨基甲酸酯等农药会对乙酰胆碱酯酶（AchE）有一定的抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，具体如图1所示。

图1 化学反应原理

1.2 反射吸光度检测原理

由于纸基芯片不透光，当单色光照射到不透明物固体表面时，发生反射和吸收，根据KUBELKA-MUNK理论[30]，光的反射遵循公式

R=/（1）

式中R为反射吸光度，为反射系数，为线性吸收系数。根据线性吸收系数的定义，与固相上吸附物的摩尔吸收光系数（）和浓度（）的关系为：

=（2）

所以可得到

R=（3）

反射系数仅和入射光界面的介质性质有关，这部分光强可以通过对应的空白参照物而抵消。所以检出信号与被测物浓度之间存在量化关系。当反射系数保持不变时，R与在一定的浓度范围内为线性关系，即反射吸光度值与溶液浓度成正比。

2 系统设计

2.1 纸基微流控芯片的设计

为了满足微流控系统对农药浓度的快速检测要求，设计的纸基微流控芯片构建了具有自动进样、混合以及显色区自动检测功能的结构，将纸基微流控芯片放置于模具上，如图2所示，a为进样区，对2个进样池分别添加底物与靛酚乙酸酯（C14H11NO2）溶液，实现进样功能；b为混合区，主要用于混合两者溶液，混合是微流控检测的关键环节，混合不充分会导致检测数据产生较大的检测误差，因此芯片设计为弯曲通道，试验验证了此微混合结构具有混合速度快、混合效率高等优点，是目前纸基微流控芯片中常用的混合方式之一；c为反应区域，底物与靛酚乙酸酯（C14H11NO2）溶液混合后经过c区域上固定的乙酰胆碱酯酶（AchE）的抑制/水解作用，产生化学反应，使生成的靛酚（C12H9NO2）到达显色区域；d为显色区域，生成物抵达显色区即可显示颜色。最后通过光电检测装置对显色区进行检测，根据反应颜色变化即可检测待测底物农药浓度。

a. 进样区；b. 混合区；c. 反应区；d. 显色区；e. 桥式复合连接结构

由于纸基的吸水性能即纸的植物纤维内部有许多微小的孔洞，纤维对水的吸引力大于水分子之间的吸引力，可以在重力作用下吸引并保留水分子，里面有大量的毛细孔，水和纸接触后，表面张力使水充满纸张内的毛细孔内。因此试剂在纸基微流控芯片内流通是依靠纸基内部毛细作用力的流动，无需外加驱动设备。

该纸基微流控芯片设计采用自动注射进样、被动式快速混合以及光电检测体系结构，不仅减少造成检测误差的因素，而且提高了检测自动化程度。

如图2中e为纸基微流控芯片的桥式复合连接结构，通过内嵌式并排通道连通芯片内反应区和显色区。在反应区中靛酚乙酸酯（C14H11NO2）经胆碱酯酶（AchE）催化水解的生成物可通过此结构到达显色区。采用此复合连接结构使生成物充分到达显色区域，解决酶抑制化学反应中显色均匀度问题。为此设计2种类型结构来进行对比试验，如下图3所示。

a. Y形结构显色结果 b. 桥式复合结构显色结果

2.2 微流控检测系统试验平台创建

系统总体设计框图如图4所示，包括纸基微流控芯片、反应环境调节设备（温控范围10~50 ℃）、光电检测装置以及芯片角度调节机构。在进行农药检测时，进样设备分别提取80L的不同浓度的农药样品试剂和靛酚乙酸酯（C14H11NO2）溶液，滴至2个进样池中，实现同时进样。通过芯片的混合区使两者充分混合到达反应区，经过反应区所固定的乙酰胆碱酯酶试剂的抑制/水解作用使生成物到达显色区。

图4 系统总体设计框图

将芯片放置于检测设备中的芯片角度调节机构上，光电传感器选用发光二极管来对纸基芯片的显色区进行检测，光敏二极管对光信号进行接收；检测电路中设计放大电路对信号进行放大，设计二阶带通滤波电路以除杂波和噪声干扰；微处理器进行数据处理、存储及信息传输等任务。光电检测系统如图5所示。

根据系统检测机理以及检测电路设计进而创建试验平台，如图6所示。电源1是为检测设备提供动力；反应环境调节设备2是为纸基芯片内提供反应条件；纸基芯片3垂直放置在发光二极管下面使芯片内显色区域充分接触灯光；光电检测装置4则是将采集的光信号转换为电信号，经过信号采集、数据采集等过程来实现农药检测；芯片角度调节机构5放置在芯片底面，通过调整角度既可优化芯片进样速度也可优化二极管对芯片照射的角度。

图5 光电检测系统结构与原理

1. 电源；2. 反应环境调节设备；3. 纸基微流控芯片；4. 光电检测装置； 5. 芯片角度调节机构

3 试验结果与讨论

3.1 试验材料

滤纸型号是what man 4号定性滤纸1004-125；靛酚乙酸酯溶液（C14H11NO2）和乙酰胆碱酯酶试剂（AchE）（江苏大学化工学院提供）；若干配置好不同浓度的敌百虫和对硫磷农药（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/L）。

3.2 试验步骤

利用滤纸材料制作纸上疏水区域，用CAD画图软件设计纸芯片的形状，再用喷墨打印机打印出芯片结构。以憎水性物质作为模具，用仪器切割技术制作相应构型，即能制作出多个疏水性能好、无边界渗透的新型纸基微流控芯片。

将芯片放置于芯片角度调节机构上，调整为最佳进样角度，用进样设备分别提取0.05 mg/L浓度的农药样品试剂与10-3mol/L靛酚乙酸酯（C14H11NO2）溶液（80L）同时注入芯片进样池中，而在纸基芯片反应区域有面积为0.785 cm2固定量为0.2 mL的乙酰胆碱酯酶试剂，足以进行酶的抑制/水解作用。等待10 min后，化学反应结束。

打开电源，使检测设备开始工作，点开显示屏，选取所要进行检测的项目，并保存显示的反射电压数据。按照以上相同步骤依次提取等量的不同浓度的农药样品试剂与靛酚乙酸酯（C14H11NO2）溶液同时注入不同芯片进样池，进而进行相关的酶抑制化学反应，最后再进行检测，并保存相对应试验数据，具体流程如图7所示。

建立反射电压与农药浓度的模型。根据模型即可对待测样品的农药残留浓度进行检测，判断该样品是否对人体有危害。

图7 试验步骤流程图

3.3 系统主要条件参数测定与优化

农药微流控检测系统主要检测条件参数包括光的波长、芯片放置角度、温度等，分别采用不同条件参数进行光电法检测，确定系统在最佳检测效果下的条件参数。

3.3.1 波长

根据农药检测中反应生成物的颜色，应确定最适宜光照探测器类型，使其反射吸收效应最佳。只有找到适宜波长范围，才能真实反应农药浓度与光吸收量之间的比例关系。因此试验分别采用浓度为0.1、0.15、0.25、0.3、0.4 mg/L的农药样品试剂在纸基微流控芯片上进行反应，并采用0 mg/L的样品试剂来增加空白对照，与其他不同浓度的农药试剂所检测的电压值形成对比。试验用不同光照探测器来进行光照处理，建立不同浓度下所对应的反射电压图并优选出最佳光照探测器作为光源。

如下图8所示即为不同类型光照探测器在不同浓度下的反射电压值。图中菱形标示的曲线是在0 mg/L的样品试剂下所检测的电压值分布图，相比于其它浓度的农药试剂所检测得到的反射电压值，在同一个波长下所对应的反射电压在0 mg/L时是最低。此时可证明在没有农药试剂进行试验的情况下，酶对靛酚乙酸酯的催化水解效果最好，反应最彻底，生成物靛酚（蓝色）颜色最深，也即是对每种光的吸收效应最佳，以此来与不同浓度的农药样品试剂形成对比，便于分析。

图8 不同浓度下反射电压值

图8中，随着农药浓度的增加，反射电压值也逐次提高。应对比选取变化率最大的波长范围，进而可确定最适宜光源来进行试验。根据这几组曲线，选用变化率最大波长为特征波长，即可知在640 nm处变化率达到最大值，此波长所对应为红色发光二极管。

3.3.2 芯片放置角度

芯片角度调节机构可调节芯片放置角度，而不同放置角度则会导致进样速度不同，同样进样速度直接影响系统后续的混合效果和光电检测精度及效率。进样速度过慢混合充分，但检测效率会大大降低；进样速度过快则会造成混合不完全从而带来较大的检测误差。因此用不同角度来表示不同的进样速度，进而确定对微流控系统检测的影响。参数测定试验采用不同芯片的放置角度即为：0°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°与50°。如用下图9所示用芯片放置角度来反应反射电压的大小，进而确定最佳放置角度。

图9 反射电压随芯片放置角度变化

因试验可得芯片放置角度为10°时系统混合效果较好，此时农药浓度检测的反射吸光度值较小，即反应充分，吸收效应好。因此可确定系统最佳芯片放置角度为10°。

3.3.3 温度

检测环境温度影响乙酰胆碱酯酶的活性，进而影响酶抑制反应的程度，而显色区颜色的深浅也随之改变，最终会影响光反射吸收强度，产生误差。为优化环境温度试验选取0.2 mg/L浓度下不同的温度来进行检测，即为：20、25、30、35、40、45 ℃。如下图10所示即是反射电压随温度变化的曲线图。

图10 反射电压随温度变化

图10中，反射电压值呈抛物线分布，在35 ℃附近值最低，说明在此温度下光吸收量最多，化学反应最彻底。而超过35 ℃条件虽会有反应发生，但酶活性受到干扰，反应较为缓慢，在一定时间内无法充分反应。因此选用35 ℃为农药检测的最佳温度。

3.4 系统性能分析与验证

在对农作物的农药残留检测中，红色发光二极管发出检测光信号，光敏二极管接收经纸基微流控芯片内显色区所反射的光信号，经过光电变换、信号采集、数据处理等过程，再通过光度检测系统中的A/D转换模块将模拟量的电信号转化为数字量的电压信号，该电压则记为反射电压。如图11所示，在相同反应条件下测定不同种类不同浓度的有机磷农药的反射电压，可根据检测数据建立反射电压与农药浓度的模型。根据模型即可针对蔬菜、瓜果等待测样品进行农药残留的检测，判断是否对人体有害。

图11中，以2种农药试剂试验对所设计的光电检测装置进行验证说明，随着敌百虫和对硫磷农药的浓度增加，反射电压值也随之增加，即反射光吸收效应相应减少，生成物的颜色（蓝色）也逐渐变淡，证明农药浓度越大，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用越强。两者的反射电压与农药浓度的线性关系分别为：=0.980+5.313（敌百虫）（虚线），=1.045+5.232（对硫磷）（实线），其中代表农药浓度，代表反射电压，线性相关系数（）分别为0.9598和0.968。体现出较好的线性度。

图11 反射电压与农药浓度的关系

a. 显示设备 b. 试验显示数据

利用图11所得到的反射电压与农药浓度的关系表达式，就可以在图12中的显示屏上直接显示所检测样品的农作物农药的含量。

利用光电检测法来测量农药浓度，可实现微型化、自动化、便携化与普及化。在同等检测条件下与便携式农药检测仪和农药速测卡进行对比，表1为所用仪器的性能及价格对比表。

表1 农药检测不同方法对比

针对便携式农药检测方法，表中所述的光电法对应的数据是用论文中所设计的光电装置检测得出，而便携式农药检测仪的数据是用型号为yps-1168品牌为WITHFIRST/佐首说明书查询得到[31]，农药速测卡数据则是用型号为FJ-NYCL品牌为ZYD检测所得。

表1中，光电法与便携式农药检测仪的检出限都为0.05，达到了国家现行的农药残留检测标准，而光电法检测时间与便携式农药检测仪和农药速测卡法相比分别缩短23%和33%，在一次性耗材上分别是农药检测仪及农药速测卡的5.21%与41.7%，虽然光电法在产品造价上比农药速测卡高，但是在分辨率可达0.002 mg/L，在检测精度上比用裸眼观察的农药速测卡高。

5 结 论

提出了一种基于纸基微流控芯片的农药光电检测方法，设计了集进样、混合、反应、显色于一体的微流控系统，并对系统工作条件参数进行了测定和优化，结果表明，光电法在检测时间上仅为10 min，而且光电检测法检出限为0.05 mg/L，与便携式农药检测仪相差不大，符合国家现行检测标准，但比速测卡法高。在试剂消耗上分别是农药检测仪及农药速测卡的 5.21%与41.7%，且易于集成化。因此此项研究为农残检测的便携化研究奠定理论依据。

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Pesticide residue photoelectric detection method based on paper-based microfluidic chip

Yang Ning1,2, Li Zhen1, Mao Hanping2※, Wang Pan1, Xiang Changhua1, Sun Jun1

(1.212013,; 2.212013,)

Abstract：A photoelectric detection method based on paper-based microfluidic chip in pesticide residues is proposed because the existing equipment has the problems of high cost, low degree of automation and large amount of reagent consumables. We design a kind of simple, portable, inexpensive paper-based microfluidic chip, whose bridge composite structure can enhance the uniformity of the color reaction of microfluidic enzyme, and also design the light path and circuit structure suitable for optical absorption reflection detection. The signal amplifying circuit and filter circuit are built to eliminate the interference of clutter and noise in photoelectric detection. Finally, a portable detection system of pesticide residue is established, which is an integrated test platform of the chemical reaction, the reflection effect in light absorption and the control of environment parameters. We observe and optimize the light source, chip placement angle, temperature and other process parameters of test platform in Jiangsu University in 2016. The reflection absorption effect of red LEDs (light-emitting diodes) is tested to be the best among the LEDs with different colors through detecting the paper-based chip color area. The response effect of the system is better when the angle is 10°according to the chip placement angle and reflected voltage data of photoelectric detection during the reaction. It is concluded that light absorption is the most under 35 ℃ and the chemical reaction is the most sufficient via comparing the color effect of the biochemical reaction of enzyme inhibition under different temperatures. We design different concentrations of pesticides, which are used for biochemical reactions of enzyme inhibition in different paper-based microfluidic chips. The resulting product displays blue color region in the paper-based chip, which can be characterized by the color of the different concentrations of pesticides. We use the photoelectric detection device to detect the color zone of the chip; the reflected voltage data can be obtained with this method, which correspond to different concentrations. Based on the experimental data, the model is established by the reflected voltage and the concentration of pesticide. The pesticide residues of test samples can be analyzed quantitatively based on the detection model. It can be concluded from the experimental results that with the method of photoelectric detection, the minimum detection limit of pesticide residues (trichlorfon and parathion) can reach 0.05 mg/L, meeting the national standard, and the resolution can reach 0.002 mg/L, much higher than that with the traditional method. Within the concentration range of pesticide residues, compared with the pesticide residues detector and the rapid detection card, the detection limit for the photoelectric detection is equivalent, but the consumable items are respectively 5.21% and 41.7% of the former 2 methods, and the reduction of time is respectively 23% and 33%. We propose a kind of pesticide residues detection system, which combines the photoelectric detection system and the paper-based microfluidic chip, and possesses the advantages of easy integration and low consumption. The research provides the theoretical basis and realistic foundation for making the pesticide residues detection develop to be portable and universal.

pesticide; agricultural products; fast detection; paper-based microfluidic chip; photoelectric detection; resolution

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.040

S124.3

A

1002-6819(2017)-03-0294-06

2016-06-07

2016-11-18

国家自然科学基金（31671584）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）（苏政办发〔2011〕6号）；中国博士后特别资助项目（2015T80512）；江苏省自然科学基金项目（BK20140550）。

杨宁，男（汉族），河南，讲师，博士，主要从事微传感与自动化检测技术。镇江，江苏大学电气信息工程学院，212013。 Email：yangn@ ujs.edu.cn

毛罕平，男（汉族），浙江，教授，博士，主要从事现代设施农业及环境自动控制技术、智能化农业装备技术、生物信息探测与传感技术、移栽机械。镇江江苏大学农业工程研究院，212013。Email：maohp@ujs.edu.cn

杨 宁，李 振，毛罕平，王 盼，项昌华，孙 俊. 基于纸基微流控芯片的农药残留光电检测方法[J]. 农业工程学报，2017，33(3)：294－299. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.040 http://www.tcsae.org

Yang Ning, Li Zhen, Mao Hanping, Wang Pan, Xiang Changhua, Sun Jun. Pesticide residue photoelectric detection method based on paper-based microfluidic chip[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(3): 294－299. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.040 http://www.tcsae.org