老年与青年小鼠慢性应激后抑郁样行为的观察*

江 岩， 李 亚

(1. 曲阜师范大学医院， 2. 曲阜师范大学生命科学学院， 山东 曲阜 273165)

老年与青年小鼠慢性应激后抑郁样行为的观察*

江 岩1， 李 亚2△

(1. 曲阜师范大学医院， 2. 曲阜师范大学生命科学学院， 山东 曲阜 273165)

目的探讨慢性应激后不同月龄小鼠抑郁样行为的变化，以及海马和前脑皮层胰岛素样神经营养因子-II (IGF-II)的作用。方法昆明品系小白鼠3月龄(青年)和14月龄(老年)，随机分为青年对照组和青年应激组、老年对照组和老年应激组，每组12只、雌雄各半。多因素慢性应激21 d，建立抑郁小鼠模型。采用悬尾实验和蔗糖偏好实验评价小鼠的抑郁样行为；并且检测小鼠海马和前脑皮层IGF-Ⅱ的表达水平。结果与青年对照组相比，老年对照组小鼠的累积不动时间明显增多(P<0.05)，蔗糖消耗度明显降低(P<0.05)，并且IGF-II阳性神经元数目在海马CA1区、CA3区、齿状回(DG)和前脑皮层均明显减少(P<0.01 或P<0.05)；慢性应激后，青年应激组小鼠的第一次静止不动时间、累积不动时间和蔗糖消耗度与其对照组比较均有显著性差异(P均<0.01)，IGF-II阳性神经元数目在CA1、DG和前脑皮层均显著减少(P<0.05 或P<0.01)；与老年对照组比较，老年应激组小鼠的第一次静止不动时间明显减少(P<0.05)、累积不动时间显著增加(P<0.05)和蔗糖消耗度明显减少(P<0.05)，海马CA1、CA3和DG区IGF-II阳性神经元数目均显著减少(P<0.05 或P<0.01)。结论慢性应激后小鼠的抑郁样行为可能与海马和前脑皮层IGF-II表达的下调密切相关。

慢性应激；抑郁；小鼠；胰岛素样神经营养因子-II；海马；前脑皮层

chronic stress; depression; mice; IGF-II; hippocampus; PFC.

抑郁症(depression)是一种常见的精神障碍性疾病，以情绪低落、行为绝望、焦虑不安以及认知功能损伤等为主要症状表现[1]，它与各类生活事件及环境应激事件相关。研究发现，在长期的慢性应激状态下，可引起前额叶皮层和海马的选择性损伤，从而导致动物出现痴呆、抑郁以及学习记忆障碍等[2]。胰岛素样神经营养因子-II(insulin-like growth factor-II，IGF-II)是神经营养因子家族中的重要成员。IGF-II能够促进脑内多种类型神经元的增殖、存活和分化，减少细胞的程序性死亡[3]。有研究报道，IGF-II在幼年和成年的大脑中均有表达[4]，并且是IGF家族中表达量最多的一种生长因子，特别是在脑内海马区的浓度水平最高。慢性应激后，不同年龄小鼠脑内IGF-II的表达如何变化，IGF-II的表达与应激所致的损伤是否有关及可能的机制，目前尚不清楚。已经明确，海马和前额叶皮层是行为调控、情绪、内分泌以及学习记忆等重要区域，也是大脑参与调控应激反应的主要区域，在抑郁的病因学研究和抗抑郁治疗中具有重要作用。因此，本研究通过悬尾实验和蔗糖偏好实验，观察慢性应激后青年和老年小鼠抑郁样行为的变化，并且测定IGF-II在小鼠海马和前脑皮层的表达，探讨IGF-II在慢性应激所致小鼠抑郁样行为变化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和慢性应激抑郁小鼠模型的建立

昆明品系小白鼠3月龄(青年)和14月龄(老年)，清洁级，雌雄各半，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心提供。不同年龄段小鼠按体重随机分为两组(n=12)：对照组和应激组。多因素慢性应激源采用：足底电击(底部铺有铜栅的刺激器，电压33 V，每次刺激持续10 s，累计刺激时间3 min)、高台(1 h/d，高1.6 m)、冷水刺激(6℃冷水游泳3 min)、斜笼饲养(24 h)、束缚+热刺激(1 h/d，30℃)。应激时程21 d，每天随机选择一种应激源对小鼠进行应激。对照组小鼠不接受慢性应激源刺激。

1.2 行为学检测

慢性应激21 d后，对各组小鼠进行行为学检测。

1.2.1 悬尾实验(tail suspension test) 在检测箱中将小鼠尾端2 cm处固定，并悬挂于支架上，头部离箱底10 cm。观察记录6 min内：小鼠从悬挂开始到第一次静止不动时间(不动潜伏期，latency immobility)和后4 min内小鼠的累计不动时间(immobility time)。判定静止不动的标准：小鼠停止挣扎，身体倒悬呈垂直状态，静止不动。

1.2.2 蔗糖消耗实验(sucrose preference test) 各组小鼠已禁水10 h 但不禁食，同时给予2%蔗糖水和纯水各一瓶，7 h 后调换蔗糖水和纯水的位置，14 h 后取走两瓶并称重。计算动物的蔗糖消耗度：蔗糖消耗度(%)= 蔗糖水消耗量/[蔗糖水消耗量(g)+纯水消耗量(g)]×100%。

1.3 小鼠海马和前脑皮层IGF-II的表达

行为学检测结束后，进行小鼠海马和前脑皮层IGF-Ⅱ的表达水平检测。小鼠腹腔注射0.4%的戊巴比妥钠麻醉，暴露心脏，经心先灌注生理盐水，再以事先冰上预冷的多聚甲醛溶液(4%)灌注，完整取脑；置于固定液中后固定，梯度酒精脱水、透明和石蜡包埋，对脑组织进行连续冠状切片(片厚5 μm)。采用SABC(链霉素过氧化复合物)免疫组织化学试剂盒，DAB显色剂进行免疫组化染色，兔抗小鼠IGF-II多克隆抗体(编号BA0941)，购于武汉博士德生物工程有限公司。以PBS(磷酸盐缓冲液)代替一抗作阴性对照。每只小鼠选择切片4张，显微镜下观察海马CA1、CA3区、齿状回(dangerous cargo, DG)和前额叶皮层(prefrontal cortex, PFC)各区IGF- II的分布，显微拍照(×400)。采用Motic Images Advanced 3.2图像分析处理系统，分析计算IGF-Ⅱ阳性神经元的数目。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠的行为学检测

悬尾实验结果显示(表1)：与青年对照组小鼠比较，老年对照组小鼠的累计不动时间明显增多(P<0.05)。慢性应激21 d后，与青年对照组比较，青年应激组小鼠的第一次静止不动时间显著减少(P<0.01)和累计不动时间显著增加(P<0.01)；与老年对照组小鼠比较，老年应激组小鼠的第一次静止不动时间明显减少(P<0.05)和累计不动时间均显著增加(P<0.05)。结果表明，慢性应激可引起青年和老年小鼠的行为绝望程度增加；而老年小鼠行为绝望程度变化稍弱。

蔗糖消耗度的变化显示：与青年对照组小鼠比较，老年对照组小鼠的蔗糖消耗度明显降低(P<0.05)。慢性应激后，青年应激组小鼠的蔗糖消耗度与青年对照组小鼠比较显著降低(P<0.01)；与老年对照组小鼠比较，老年应激组小鼠的蔗糖消耗度亦明显降低(P<0.05)。结果表明，慢性应激可引起小鼠蔗糖偏好程度降低、快感缺失明显。

Tab. 1 The changes of behaviors in different ages mice(±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsyoung control

2.2 各组小鼠脑内IGF-II的表达

统计结果显示，与青年对照组比较(表 2)，老年对照组小鼠在海马CA1、CA3、 DG和PFC各区的IGF-II阳性神经元数显著减少(P<0.01 或P<0.05)。慢性应激后，与各自的对照组小鼠比较，青年应激组小鼠海马CA1、DG区和PFC的IGF-II阳性神经元数明显减少(P<0.01或P<0.05)；老年应激组小鼠在海马CA1、CA3和DG区的IGF-II阳性神经元数亦显著减少(P<0.01 或P<0.05)。

Tab. 2 The numbers of IGF-II positive neurons in different ages mice brain(±s)

DG: Dangerous cargo; PFC: Prefrontal cortex

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsyoung control

3 讨论

有研究报道，过强或长期的慢性应激，可引起机体的功能紊乱，从而导致某些疾病的产生[5]。多因素慢性应激可使海马神经元树突和轴突的生长出现异常[6]，进而影响突触传递效能，导致学习记忆功能障碍并且出现快感缺乏、绝望等抑郁样行为[7]。前额叶皮层在行为调控、工作记忆等高级功能中具有关键性作用；不同的应激刺激，亦可引起前额叶皮层功能损伤[8]。在本研究中，给予慢性应激后，青年和老年小鼠表现出行为绝望、快感缺失等明显的抑郁样行为。多因素慢性应激是一种常见的建立抑郁动物模型的方法，通过悬尾实验和蔗糖偏好实验可以有效的评价小鼠的抑郁样行为表现。本实验室早先的研究显示，给予小鼠应激刺激21 d后，小鼠在开场环境中的紧张焦虑程度、运动能力和探究行为都出现明显改变，并且其空间学习记忆能力显著降低[9]。

IGF-II属于胰岛素多肽超家族中的重要成员。研究发现，IGF-II及其受体，以及IGF结合蛋白在啮齿类动物大脑的主要发育时期都有丰富表达；在幼年和成年的动物脑内，IGF-II的表达表现为随年龄的增高而降低[4]，具有增龄性变化，推测IGF-II可能影响神经元的生长发育以及脑的老化过程。IGF-II的水平从12月龄大鼠起出现显著下降，到24月龄大鼠(老年)时趋于稳定；在成年动物大脑中，IGF-II有广泛的表达，其中在海马区的浓度最高；通过增加海马IGF-II的表达，亦可产生明显的抗抑郁效应[10]。近年的研究报道，慢性限制性应激可减少大鼠海马IGF2的表达水平，而在海马过表达IGF2则可减轻大鼠的抑郁样行为[11]。而前额叶皮层IGFs家族(包括IGF-II)基因的表达，可能参与皮层神经元的保护作用[12]。本研究发现，慢性应激后，青年和老年小鼠海马和前脑皮层IGF-II阳性神经元数目均减少，说明海马各区和前脑皮层IGF-II的表达降低。因此，本研究结果提示，慢性应激后小鼠的抑郁样行为可能与海马和前脑皮层IGF-II表达的下调密切相关。

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R338

A

1000-6834(2017)04-313-03

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2016-08-02

2017-05-17

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10.12047/j.cjap.5485.2017.076